抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）国家参考品的建立

孙彬裕，曲守方，于婷，孙楠，孙晶，胡泽斌，黄杰

抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）国家参考品的建立

孙彬裕*，曲守方*，于婷，孙楠，孙晶，胡泽斌，黄杰

100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所

ABO 血型系统是人类第一个血型系统，也是人类血型系统中抗原免疫性最强的[1]。至今人们已发现红细胞上有 36 个血型系统，300 多种血型抗原。ABO 血型系统是临床输血和器官移植中最重要的血型系统，对献血者和受血者 ABO 血型的预先确认是输血工作中最为重要的实验，错误的 ABO 血型定型将导致严重的输血反应[2-3]。《血站技术操作规程》（2015 版）对血型检测项目规定的强制检测项目就是ABO 正确定型[4]。ABO 血型鉴定必须同时进行正反定型试验，使两者的检测结果相互验证，才算定型正确。正定型是用已知的抗 A 和抗 B 血型定型试剂测定红细胞上有无相应的 A 抗原或（和）B 抗原；反定型是用已知 ABO 血型的红细胞测定血清中有无相应的抗 A 抗体或（和）抗 B 抗体[5]。抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）是按照生物制品管理的用于血液筛查的体外诊断试剂产品，目前需要批签发。国家药品监督管理局已经批准了 8 个国内外不同公司的抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体），应用于正定型鉴定 ABO 血型。

抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）进行效价测定时，可能会因为不同实验者试验方法和主观判断等因素，影响实验结果。目前国际通用的方法是制备统一的参考品用来限定血型定型试剂产品的最低效价，要求试剂的效价应不低于参考品的效价[6]。《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部明确规定了正定型类抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）的通则，并要求其对红细胞的凝集效价应不低于国家参考品的同步测定结果[7]。因此本实验室开展了抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品的研制工作，该参考品可以规范抗 A 抗 B 血型定型试剂效价的检测，促进测定结果标准化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 抗 A 杂交瘤细胞培养上清液（细胞株为 SRBC-B3 和 9113D10）和抗 B 杂交瘤细胞培养上清液（细胞株为 SRBC-C 和 9621A8），效价为 1:2048，由上海血液生物医药有限责任公司提供。

1.1.2 仪器 90-1 型恒温磁力搅拌器购自上海精科实业有限公司；QL-901 型漩涡混合器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Microlab®540B 配液仪购自瑞士 Hamilton 公司；DT5-3 血型离心机购自北京时代北利离心机有限公司；YB-IIA 型澄明度检测仪购自天津市精拓仪器科技有限公司。

1.1.3 试剂 红细胞为 3 d 内新鲜采集的红细胞。

1.2 方法

1.2.1 制备及检测

1.2.1.1 制备 将原料抗 A 杂交瘤细胞培养上清液和抗 B 杂交瘤细胞培养上清液加入等体积的赋形剂（蔗糖溶液），充分混匀后，配制成参考品候选品溶液，置于 2 ~ 8 ℃过夜。次日经 0.22 μm 滤膜无菌过滤，按每支安瓿 1.0 ml 进行分装。冻干制备成抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品。

1.2.1.2 检测 实验室按照《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部要求，对抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品进行外观、特异性、亲和力、效价、冷凝集素和不规则抗体等项目的检测。

外观：参考品使用时应先用 1.0 ml 去离子水将内容物完全复溶，再加入 5.0 ml 2% 牛血清白蛋白生理盐水配制成标准液备用。选择 2200 光照度（lx），手持瓶颈部于遮光板边缘处，轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮（注意不使药液产生气泡），在明视距离（供试品至人眼的清晰观察距离，通常为 25 cm）分别在黑色和白色背景下目测 20 s，肉眼观察液体情况。

特异性：取试管排 2 行，每行4 支试管，每行分别加入抗 A 血型试剂国家参考品和生理氯化钠 0.1 ml，每列分别加入2% A1、A2B、B、O 型红细胞悬液 0.1 ml；取试管排 2 行，每行3 支试管，每行分别加入待检抗 B 血型试剂国家参考品和生理盐水 0.1 ml，每列分别加入2%A1、B、O 型红细胞悬液 0.1 ml。置 18 ~ 25 ℃ 15 min，经1000 r/min 离心 1 min，肉眼观察凝集结果。

亲和力：将待检抗 A 血型试剂国家参考品 0.05 ml 置洁净玻片上，加入等体积10% A1、A2、A2B 型红细胞悬液；将待检抗 B 血型试剂国家参考品 0.05 ml 置洁净玻片上，加入等体积10% B 型红细胞悬液。立即混匀，滴入红细胞悬液同时记录肉眼可见凝集出现时间以及凝块大小。

效价：取试管排成2 排，每排10 支，自第一管起每支各加生理氯化钠溶液0.1 ml，加待检试剂0.1 ml，2 倍系列稀释，然后加2% 相应红细胞悬液0.1 ml，摇匀，于18 ~ 25 ℃放置 15 min，经 1000 r/min 离心 1 min，同时用生理氯化钠溶液做红细胞悬液对照。效价以产生“+”凝集的待检试剂最高稀释度计算，不计红细胞悬液体积，2 排试管终点相同作为待检试剂凝集效价，如果 2 排试管终点相差 1 管，则以凝集效价低的判为终点，如 2 排试管终点相差 2 管或以上，需重新进行标定实验。

冷凝集素和不规则抗体测定：随机取 10 例非血缘性 O 型红细胞、3 例A 型红细胞和 3 例 B 型红细胞，分别用生理氯化钠溶液配成 2% 红细胞悬液，用 20% 牛白蛋白生理氯化钠溶液配成 5% 红细胞悬液。每一待检试剂排3 排试管，每排 13 支，各加待检试剂 0.1 ml，前 10 管分别加入 O 型 2% 红细胞悬液 0.1 ml，后 3 管分别加入B 型 2% 红细胞悬液 0.1 ml（测待检抗 A 试剂）或者加入A 型2% 红细胞悬液 0.1 ml（测待检抗 B 试剂），第一排置 4 ℃，第二排置 18 ~ 25 ℃，第三排置 37 ℃，静置 2 h。牛白蛋白介质按上法进行，排成两排，分别置 18 ~25 ℃及 37 ℃，静置 2 h，观察凝集结果。

1.2.2 瓶间精密度实验 随机抽取 2 支抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品，各协作标定实验室按照《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部要求检测试剂效价和亲和力，平行进行分析测定，并统计结果。

1.2.3 热稳定性实验 随机抽取抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品进行稳定性试验。将国家参考品置 37 ℃放置 3、7、14 d 后，各协作标定实验室检测效价和亲和力。以–20 ℃保存的国家参考品（记为 0 周）为对照，对热稳定性的国家参考品平行进行分析测定。

1.2.4 效价协作标定结果 四家协作标定实验室按照《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部要求检测试剂效价，平行进行分析测定，并统计效价结果，确定抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品的效价。

2 结果

2.1 国家参考品检测结果

外观检测：抗 A 血型定型试剂国家参考品为蓝色冻干粉末，抗 B 血型定型试剂国家参考品为黄色冻干粉末。复溶后外观抗 A 血型定型试剂国家参考品为蓝色透明液体、抗 B 血型定型试剂国家参考品为黄色透明液体，均无摇不散的沉淀和异物。特异性检测：抗 A 血型试剂国家参考品与 A1、A2B 型红细胞凝集，与 B、O 型红细胞不凝集，没有溶血等不易分辨的现象；抗 B 血型试剂国家参考品与 B 红细胞产生凝集，与 A1、O 型红细胞不产生凝集，没有溶血等不易分辨的现象。亲和力检测：与相应的红细胞的凝集时间均在 15 s 以内，3 min 凝集块 > 1 mm2。效价检测：抗 A 血型定型试剂国家参考品结果为对 A1 细胞 1:256，对 A2 细胞 1:128，对 A2B 细胞 1:128，抗 B 血型定型试剂国家参考品结果为对 B 细胞 1:256，见表 1。冷凝集素和不规则抗体检测的结果均为无凝集反应或溶血现象。各项结果均符合《中华人民共和国药典》（2015 年版）中的规定。

2.2 瓶间精密度实验结果

按照《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部要求，对抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品的效价和亲和力进行检测，结果均为对 A1细胞的效价 1:256，对 A2细胞的效价为 1:128，对 A2B 细胞的效价为 1:128，对 B 细胞的效价为 1:256，结果表明瓶间效价无显著差异。

表 1 热稳定性实验结果

续表 1

2.3 热稳定性实验结果

将国家参考品在 37 ℃放置 3、7、14 d 后，进行效价和亲和力检测，并与–20 ℃保存的国家参考品（作为0 周）效价比较，效价一致且均未下降，亲和力的结果也符合药典的要求，即相应的红细胞的凝集时间均在 15 s 以内（表 1），3 min 凝集块> 1 mm2。实验结果表明国家参考品非常稳定。

对各协作标定实验室的标定结果进行统计分析和汇总，见表 2。效价为抗 A 血型定型试剂国家参考品对 A1细胞 1:256，对 A2细胞 1:128，对 A2B 细胞 1:128，抗 B 血型定型试剂国家参考品对 B 细胞 1:256。

表 2 协作标定结果

3 讨论

ABO 血型是人类稳定的遗传标志物，ABO 抗原不仅存在于红细胞膜上，也广泛存在于人体的体液和分泌液中。传统的 ABO 分型是采用血清学方法。ABO 血型鉴定的原理基于抗原和抗体反应所产生的细胞凝集，通过正定型（细胞定型试验）和反定型（血清定型试验），判定 ABO 血型。而正定型的抗 A 抗 B 血型定型试剂的效价是该产品一项重要的技术指标。但是各家产品测定结果有明显的差异性，所以研制抗 A 抗 B 血型定型试剂国家参考品能规范抗 A 抗 B 血型定型试剂效价的检测。

体外诊断试剂质量的提高有赖于国家标准物质水平的提高和完善。产品注册检测工作中如果缺乏统一的国家参考品，检测时只能由企业提供自己的参考品。如果缺乏统一的尺度，势必给试剂盒的注册和上市后的监管工作带来很大的影响。为了加强抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）质量的控制，迫切需要建立用于效价评价用的国家参考品，以便对市场上的抗 A 抗 B 血型定型试剂进行科学合理的监管。建立的抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）国家参考品，可以用于评价试剂盒的效价评价，对于提高产品的质量具有十分重要的意义。

抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）是按照生物制品管理的体外诊断试剂产品，在《中华人民共和国药典》（2015 年版）三部里面对该产品的外观、特异性、亲和力、效价、冷凝集素和不规则抗体检测进行了详细的规定，并要求其对红细胞的凝集效价应不低于国家参考品的同步测定结果。因此对该产品进行效价检测时，必须同步使用国家参考品进行检测。而国家参考品效价的准确标定，影响着该类产品的质量评价。研究报道，不同实验室虽然使用相同的实验方法，但是由于不同实验人员的操作方式以及对凝集结果的主观判断、不同批次的红细胞表面抗原的差异等因素，可能会影响效价的结果[8]。为了避免红细胞的影响因素，我们建议各个协作标定单位使用 3 d 内新鲜采集的红细胞进行检测。抗 A 抗 B 血型定型试剂（单克隆抗体）国家参考品经中国食品药品检定研究院、上海血液生物医药有限责任公司、长春博德生物技术有限公司和北京金豪制药股份有限公司四家单位协作标定，效价均为对 A1细胞的效价 1:256，对 A2细胞的效价为 1:128，对 A2B 细胞的效价为 1:128。国家参考品的瓶间精密度结果为各瓶的效价均一致，表明瓶间无显著差异。将国家参考品在 37 ℃放置3、7、14 d 后，与–20 ℃保存的国家参考品效价比较，效价均未下降，表明国家参考品稳定性很好。该国家参考品已经于 2018 年开始使用，效价稳定，能够满足抗 A 抗 B 血型定型试剂效价的评价要求。我们同时将对该国家参考品进行长期稳定性研究以及期间核查，以确保长期放置后的效价依然满足国家参考品的要求。

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*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.015

黄杰，Email：jhuang5522@126.com；胡泽斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-02-11