高效液相色谱-示差折光测定蜂蜜中5种还原糖的含量

马蓉 徐昊 李红梅 周露 徐虹 范明红

摘  要：目的：建立一种蜂蜜中5种还原糖含量的测定方法。方法：色谱柱采用上海安谱公司的CNW Athena NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈（A有机相）和水（B无机相）的比例为82∶18为流动相，采用Waters 2414示差折光检测器外标法测定蜂蜜中5种还原糖的含量。结果：蜂蜜中5种还原糖的线性范围在2.5～40mg /mL，该方法的最小检出限为5mg/L，加标回收率在90.95%～100.02%，方法的相对标准偏差在1.43%～5.44%。结论：该方法精密度好、回收率和准确度较高，适用于蜂蜜中5种还原糖含量的定量分析。

关键词：蜂蜜;果糖;麦芽糖;葡萄糖;蔗糖;乳糖;高效液相色谱

中图分类号 S896文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）13-0042-03

蜂蜜是老少皆知的健康食品，依据花源的不同，可分为油菜花蜜、椴树蜜、洋槐花蜜、枣花蜜等[1-6]。蜂蜜中的还原糖主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖5种，其常用的测定方法有菲林试剂法和高效液相色谱法。菲林试剂法对操作者要求较高，是一种常见的理化方法，而高效液相色谱法检测准确度高，也比较简便。本研究采用高效液相色谱-示差折光的方法，对蜂蜜中5种还原糖含量进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 蜂蜜样品（超市购买）、果糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、葡萄糖（aladdin，99.5%）、麦芽糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、蔗糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、乳糖（中国计量科学研究院，99.5%）;乙腈（色谱纯，上海弗霓）。美国沃特士（Waters）e2695高效液相色谱并且配备了Waters 2414示差折光检测器;本文所用的超纯水由Synergy超纯水机（美国密理博公司）自制。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件选择 采用上海安谱公司产的CNW Athena NH2柱（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相采用乙腈（A有机相）和水（B无机相）比例为82∶18;检测池温度：35℃;柱温：25℃;进样量5μL;流速1.0mL/min。

1.2.2 标准溶液配制 准确称取5种还原糖对照品，用超纯水溶解配制成2.5，5，10，20，40mg/mL的混标溶液，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，取滤液备用，作为混合对照品溶液。

1.2.3 样品溶液配制 在50℃水浴中加热至蜂蜜样品中结晶溶解搅拌均匀后，准确称取5g左右的样品，置于100mL容量瓶中，加入水至刻度，取上清液过0.22μm滤膜，上机测试。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 精密吸取5种糖混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，以仪器响应值对应的峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。由图1可知，相关系数都在0.99以上;5种糖在2.5～40mg/mL线性关系良好;并以信噪比等于3为标准，测得5种还原糖的检出限为5mg/L。

2.2 精密度 精密吸取5种还原糖混合对照品溶液10μL重复进样6次，记录色谱图峰面积，并测定峰面积的平均值和相对标准偏差，测定结果见表1。由表1可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖精的相对标准偏差为0.63%、0.88%、1.03%、0.65%和1.72%。本实验测定5种还原糖含量的精密度良好，具有良好的准确度。

2.3 重复性 取同一种蜂蜜样品，按照1.2.3供试样品溶液制备方法前处理，然后上机重复测定6次，记录色谱图，测定结果见表2。由表2可知，重复性实验中，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的相对标准偏差分别为4.63%、2.84%、2.09%、0.13%、0.13%。表明用本方法测定5种还原糖含量重复性良好。

2.4 回收率 按照上面的测定方法和仪器条件，分别在蜂蜜样品中添加对照品5.00和10.00mg的5种混合还原糖，进行5种还原糖的回收率和精密度实验，测定结果见表3。由表3可知，5种还原糖的回收率在90.95%～100.02%，并且重复测定5次，计算各组分的相对标准偏差在1.43%～5.44%。表明高效液相色谱-示差折光法能够满足蜂蜜中5种还原糖含量需求。

2.5 样品测定 取市场购买的5种蜂蜜样品按照上面方法和条件进行测试，以外标法计算含量，结果见表4。由表4可知，蜂蜜中的还原糖主要是果糖和葡萄糖，蔗糖含量次之，另外蜂蜜中还含有微量的麦芽糖和乳糖。5种还原糖的HPLC色谱图见图2。由图2可知，通过上述条件标准品中5种还原糖能够达到很好的基线分离，5种还原糖的出峰时间在5～16min，结果令人满意。

3 讨论与结论

还原糖易溶于水，所以前处理直接用水定容，过微孔滤膜进仪器检测，检测过程中主要是注意控制柱温，示差折光检测器对温度要求很高，另外氨基柱的使用跟存放也需要注意，存放不当会导致柱效降低。本实验针对蜂蜜中5种还原糖含量的测定，具有良好的准确度、精密度和回收率，适用于蜂蜜中5种还原糖含量的测定。

参考文献

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[2]赵文惠，曾诚，丛媛媛，等.高效液相-示差折光法比较新疆产地8种蜂蜜中4种糖的含量[J].食品安全质量检测学报，2015，6（10）：4193-4198.

[3]袁梦，马玉晨.效液相色谱-示差折光法测定蜂蜜中三种还原糖含量[J].食品与发酵科技，2015，51（1）：87-90.

[4]李水芳，张欣，李姣娟，等.拉曼光谱法无损检测蜂蜜中的果糖和葡萄糖含量[J].农业工程学报，2014，30（6）：249-255.

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[6]蒲晓亚，杜旭升，刘泊，等.蜂蜜中果糖和葡萄糖含量测定问题的研究[J].安徽农业科学，2015，43（32）：147-148.

（責编：张宏民）