Nebovirus的分子检测及VP1基因遗传演化分析

2019-08-19颜超跃艾梦燕

兽医导刊 2019年12期

颜超跃艾梦燕汤承

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610225）

Nebovirus（NeV）是杯状病毒科（Caliciviridae family）纽布病毒属（Nebovirus genus）唯一成员（https：//talk.ictvonline.org/）。NeV为单股正链RNA病毒，是致犊牛腹泻的病毒[1-4]。根据RdRp基因序列，NeV可以分为2种基因型（NB-like和NA1-like）；根据完整VP1序列，NeV可以分为2种基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又细分为4个谱系（谱系1～4）[5]。迄今为止，NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出，具有广泛的地域分布[6-16]。最近本实验室首次证实NeV在国内的存在，并在国内奶牛中广泛流行[17，18]。

NeV基因全长7，453～7，454 bp，分为2个ORFs[19]。ORF-1的长度为2，210个氨基酸（aa），依次编码P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro、RdRp和VP1蛋白[20]。ORF-2的长度为225 aa，编码次要衣壳蛋白（VP2）[2]。NeV的VP1基因的核苷酸长度为1，650 bp，编码549个氨基酸（aa）。NeV VP1是重要的结构蛋白，参与病毒与组织血型抗原（HBGAs）的结合[21]。此外，其它杯状病毒的VP1被证实具有宿主特异性、抗原性和免疫原性[22-24]。NeV VP1由P结构域和S结构域组成[25]。P结构域进一步分为两个子结构域，P1和P2。其中高度突变的P2结构域含有受体结合位点，负责宿主特异性和毒株多样性[26]。

本次研究旨在进一步了解国内牛NeV VP1分子的特征，为NeV的防控和疫苗的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2018年10月，从辽宁某牧场采集20份奶牛腹泻样本于-80℃保存。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzolTMReagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMDTM19-T Vector均购于TaKaRa公司；感受态细胞DH5ɑ、Cycle-pure Kit、Gel Extraction Kit均购于大连宝生物工程股份有限公司。高速冷冻离心机5810R（德国Eppendorf）；普通梯度PCR仪（美国BIORAD）；凝胶成像分析系统5200Multi（中国天能）；电泳电源EPS300（中国天能）。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

将腹泻粪便样本与PBS按照1：5（W：V）的比例重悬混合，5000 r/min离心4 min，取400 μl上清液于1.5 ml的Ep管中，按照TRIzolTMReagent的说明书提取总RNA，并按反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。

1.4 NeV的检测

NeV的检测采用国外文献报道的巢式RT-PCR方法[24]。

1.5 完整的VP1基因的克隆

根据GenBank中的NeV的完整VP1基因序列，利用Primer 5.0和DnaSP软件设计包含重叠区域的4对引物，分段扩增的NeV完整VP1基因，引物均由生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表1。

优化的25μl反应体系：EmeraldAmp PCR Master Mix（2×Premix）10 μL，上、下游引物各1.0 μl，模板1.5 μl，用ddH2O补齐到25 μl。反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35循环，72℃ 5 min。纯化PCR产物，连接至pMDTM19-T载体，转入感受态细胞DH5ɑ，筛选阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养8 h后送生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 VP1序列的拼接及遗传进化分析

利用DNASTAR EditSeq和Seqman软件将VP1上各片段进行剪辑拼接，获得完整的VP1基因序列。用MegAlign软件进行相似性分析，用MEGA 5.2软件的最大似然法构建进化树。

2 结果

2.1 腹泻粪便样本中NeV检测结果

从20份腹泻奶牛粪便样本中检测出13份NeV阳性样本，检出率为65.0%。PCR产物的凝胶电泳图见图1，条带与预期大小一致。

图1 NeV巢式PCR检测结果

2.2 NeV VP1基因的序列及遗传进化分析

成功得到3个NeV完整VP1基因序列，毒株名为Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH。本次实验得到的3个完整的NeV VP1基因序列之间的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%～99.8%和99.1%～99.6%，与GenBank中登录的NeV VP1基因核苷酸和氨基酸相似性分别为82.3%～95.6%和92.3%～98.9%，与国内NeV VP1基因核苷酸、氨基酸相似性都表现为最高，分别达94.2%～95.6%、96.2%～98.9%。NeV VP1基因序列的氨基酸遗传进化树显示，本实验获得的Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株在进化树上单独聚于一支，均为基因1型的谱系1毒株，与国内的辽宁、河南、四川、山东NeV毒株的遗传关系最近，但是有一定的遗传距离（图2）。进一步分析发现，Bo/HS-2/19/CH与其他所有NeV相比，表现为在53位处的氨基酸由A→T，211位的氨基酸由N→S。Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株与其他所有NeV相比，表现为在291位的氨基酸由R→H。

表1 扩增NeV VP1完整基因的引物信息

3 讨论

与全球趋势一致，腹泻作为是我国犊牛最常见的疾病之一，其导致严重的经济损失[27]。NeV作为一个重要的致犊牛腹泻的病毒[28]，本实验室已经证实该病毒在我国存在并广泛流行[17，18]。本研究对一个牧场的奶牛腹泻样本进行分子检测，检出率为65.0%。高检出率表明该病毒可能是这个牧场的重要的腹泻病毒，这对该牧场奶牛腹泻疾病的防控提供参考。

遗传进化树表明，本次实验获得的Bo/HS-2/19/CH、Bo/HS-6/19/CH、Bo/HS-10/19/CH株在进化树上单独聚于一支，均为基因型的谱系1毒株，与国内NeV毒株的遗传关系最近，但是有一定的遗传距离。VP1是NeV的主要结构蛋白，参与病毒与HBGAs的结合[21]。此外，其它杯状病毒的VP1被证实具有宿主特异性和免疫原性[22，23，29]。本研究Bo/HS-2/19/CH在53位的氨基酸由A→T，21位的氨基酸由N→S和高变的P2结构域的291位氨基酸由R→H，这3个氨基酸的突变对其VP1功能影响有待于进一步研究[30，31]。