奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验

侯明飞 范 涛

（山东省宁阳县行政审批服务局，山东宁阳 271400）

乳房炎是一种危害奶牛产业的重要疾病，不仅影响奶牛的产奶量，而且降低牛奶的品质，影响人体健康，延长奶牛产后发情和妊娠时间。奶牛乳房炎的发生较复杂，化学性刺激、物理性刺激，饲养管理不善等各种因素均可诱发，乳房感染致病性或条件致病性微生物，进而发生乳房炎。引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，有细菌、真菌、病毒、支原体等，但主要由细菌引起。据有关报道，奶牛乳房炎中以金黄葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌这五种细菌最为常见。

目前对奶牛乳房炎诊断和检测有乳汁细胞学检查法、乳汁pH检查法和乳汁导电性检查法等多种方法，但是这些方法存在繁琐、耗时、费力等缺点[1]。而PCR技术具有有效、快速、简便的优点，所以此次试验采用PCR技术检测和鉴定这五种奶牛乳房炎主要病原菌。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

来自泰安地区奶牛场，采集牛奶约5～10 ml放入灭菌瓶中，作好标记，冰浴中送回实验室，4℃保存，共47份。

1.1.2 引物

根据NCBI和相关文献资料设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。详细见表1。

表1 PCR反应中的引物

1.1.3 试验试剂

2*power Taq PCR Mastermix购自BIOTEKE CORPORATION公司，DL2000 DNA Marker，药敏片：庆大霉素、头孢唑啉、红霉素、环丙沙星、卡那霉素、林可霉素、大观霉素，营养琼脂，兔血，其他。

1.1.4 主要仪器设备

PCR仪购自Gene Amp公司，电泳仪，紫外凝胶成像仪，DRP-9082型电热恒温培养箱、DKS12型电热恒温水浴锅均购自上海森信实验仪器有限公司，紫外分析仪UV-型购自北京宾达英创科技有限公司，台式高速离心机Neofuge13购自上海力申科学仪器有限公司，胶回收试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养

奶样摇匀，在无菌条件下接种到兔血培养皿，至37℃恒温培养箱培养24～48h，然后选取可疑菌落接种到营养琼脂或兔血培养皿上，至37℃恒温培养箱培养24h，然后将细菌接种到液体培养基，至37℃恒温培养箱培养24h。

1.2.2 提取DNA

取菌液1.5 ml至于离心管中，5 000r/min 4℃离心4min，弃上清，加入500 mL TE（ph8.0）煮沸10min，立即放入冰水中3min，1 000r/min 4℃ 离心3min，取上清，作为PCR模板，-20℃保存备用。

1.2.3 多重PCR

总反应体系25 μl。包括Taq mix 12.5μl，模板1 μl，金黄葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌上下游引物各1 μl，水2.5 μl；Taq mix 12.5 μl，模板4 μl，乳房链球菌、停乳链球菌上下游引物各1 μl，水4.5 μl。放入PCR仪反应。取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统观察结果并成像。

1.2.4 胶回收和PCR产物的鉴定

根据试剂盒进行胶回收，DNA送往上海生工测序，与NCBI上发布的基因序列进行比对。

1.2.5 药敏试验

采用纸片扩散法，检测上述五种细菌对上述七种药敏片的敏感程度。调节菌液（上述1.2.1制备）浓度，取少量均匀涂于兔血培养皿中，用无菌镊子夹起，按一定距离贴于培养皿中，于37℃恒温培养24h。用直尺测量抑菌圈直径，计算同一种细菌不同药敏片的平均抑菌圈直径，直径小于16 mm为不敏感，16～20 mm为中度敏感，大于20 mm为高度敏感。

2 结果

2.1 细菌分离结果

共47份样品，44份样品生长出细菌。

2.2 PCR结果

金黄葡萄球菌检测率为79%，大肠杆菌检测率为72%，无乳链球菌检测率为2%，停乳链球菌检测率为20%，乳房链球菌检测率为18%，奶牛多为混合感染，单独感染极少。

2.3 DNA测序

经过测序，PCR扩增的序列分别与NCBI发布的基因序列基本一致，同源性高达98%以上。利用多重PCR扩增的DNA片段，分别与各种细菌的基因片段同源，PCR的鉴定结果，能够作为该种细菌存在的验证。

2.4 药敏试验结果

选用庆大霉素、红霉素、头孢唑林、环丙沙星、卡那霉素、林可霉素、大观霉素进行药敏试验。结果见表2。

表2 几种药物对细菌的平均抑菌圈直径（单位：mm）

3 讨论

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最严重的疾病之一，在我国奶牛乳房炎发病数量一直很高，所产生的经济损失在奶牛疾病中居于首位。引起奶牛乳房炎的原因主要有两方面：第一是由环境因素引起的，如病原菌通过泥土、粪便等传播感染牛，该途径感染的病菌主要有乳房链球菌、大肠杆菌等；第二方面，是通过挤奶感染，如擦洗乳房用的毛巾、水等接触传播，该途径多为传染性病原菌感染，如无乳链球菌、金黄色葡萄球菌。因此，保持牛舍清洁、牛身体的卫生、避免交叉感染，是预防奶牛乳房炎的重要措施。

目前，奶牛乳房炎病原菌的检测，主要靠细菌微生物学培养和生化试验。有时诊断隐性乳房炎产生假阴性结果、乳汁中存在较高体细胞数影响细菌的生长、工作量很大并至少需要 2～ 3d 时间才能做出鉴定，有许多局限性。在临床条件下，快速、有效的对病原做出检测对奶牛乳房炎的防治非常重要。随着分子生物学的发展，尤其是 PCR 技术的完善与应用，使得对乳房炎病原菌的检测可以在数小时内完成。

细菌耐药性与抗菌药物长期使用有关，在临床治疗选择几种比较敏感的药物合用或交替使用，减少单个药物的使用剂量或使用时间，可减缓耐药菌株的产生。因此，临床治疗可根据药敏试验结果，并综合考虑药物的成本和安全等因素，尽可能选择有效的抗菌药物，减少耐药菌株的出现。目前已有大量报道表明，中药在奶牛乳房炎防治中起到重要作用。除药物防治外，更应保持奶牛圈舍环境的清洁、卫生、通风、干燥，建立合理的饲养管理制度，从根本上减少奶牛乳房炎的发病。因此控制奶牛乳房炎的发生，除了选择敏感的药物进行治疗外，还必须采取一系列综合预防措施。