猪源抗菌肽PR-39的抗菌性能及其热稳定性的测定

付雪丽 田 奎 刘凯迪 王浩杰 刘保国 李月涛 胡建和

(河南科技学院,河南新乡 453003)

抗菌肽（AMPs）是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽。天然生物抗菌肽抗菌谱相对较为广泛，在特性上表现出突出的水溶性、热稳定性，在高等动物正常细胞环境中，不存在毒害性，且不易产生耐药性。据统计，在各种动物组织中发现具备抗菌特性的多肽、蛋白质种类已超出千种，且有70余种的结构已被测定。猪源抗菌肽PR-39是抗菌肽中的重要一种，它是从猪体内分离得到的抗菌肽，具有良好的抑菌效果。本试验通过对抗菌肽的最小抑菌浓度进行测定，检测耐热性等，为该类产品应用于畜牧科研领域提供一定的数据与资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用的抗菌肽PR-39通过质谱鉴定，其纯度指标超出了98%，系上海吉尔生化企业生产产品。在本分析中，选用的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541、金黄色葡萄球菌（923）鼠 伤均购自中国兽医药品监察所。①液体培养基：MH液体培养基200ml高压灭菌20min，121℃②固体培养基：LB固体培养基每100ml需加胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，另加琼脂粉1.5g（高压灭菌20min，121℃，备用）。

1.2 方法

1.2.1 产品配制

选取一定量的抗菌肽产品，要求使用无菌蒸馏水进行配置，配置溶液的标准浓度为1、2mg/ml。

1.2.2 抗菌肽产品抗菌活性的测定

（1）双层琼扩法测定抑菌活性

在这里应用的是LB固体培养基，即一般的琼脂培养基，进行4h时间的活化培养，然后对菌液浓度进行稀释处理，处理标准要求达到106～107CFU/ml。然后对活化后的细菌进行两次离心来达到纯化的目的。吸取纯化后的菌液于装有LB固体培养基中（此时为液体状态，温度大约50℃左右），每100ml培养基中加入334μl的菌液。将培养基倒入琼脂板中，等待凝固后进行打孔，每个板打三个孔，分别注入20μl浓度为2mg/mL的抗菌肽、20μl相同浓度的氨苄霉素、20μl的水（阴性对照）。将平板放入培养箱内，温度设定为37℃，在培养24h后对小孔周围作仔细观察，记录是否出现菌圈与菌圈具体的规模。

（2）最小抑菌浓度的测定（MIC测定）

将细菌在LB固体培养基平板上进行划线培养，然后放37℃恒温培养16-18h左右。挑取菌落接种到5mlMH液体培养基中，放摇床上，37℃，180rmp/min，大约摇12h左右。吸取100μl菌液于4.5mlMH液体培养基继续放在摇床上，180rmp/min摇4h活化（此时菌液浓度为108CFU/ml）。然后用MH液体培养基将上述菌悬液以1：1000比例进行稀释，使菌液浓度达到105.CFU/ml。向96孔板每孔中分别加入100μl混匀后的MH菌悬液至第11排。吸取100μl浓度为1mg/ml的抗菌肽溶液添加到第一个孔中，反复吹打均匀，尽量不要有气泡，（枪头最好在液面以下吹打），然后从第一个孔中吸取100μL液体至第二个孔中，吹打均匀，以此类推，重复此操作至第10孔，吸取100μl液体弃去，此时每孔中的抗菌肽浓度分别为：2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、单位：mg/ml）。第11孔中不加抗菌肽，作阴性对照。第12孔中加入50μl浓度为1mg/ml的抗菌肽溶液与50μl的空白MH培养基，作阳性对照。将96孔板盖上盖子置于恒温培养箱中培养，培养温度设定为37℃，时间控制在16～18h范围内，对细菌最小抑制浓度进行分析与记录。

1.2.3 抗菌肽产品热稳定性的测定

完成各种浓度药液配置之后，将溶液置于99.2℃的沸水环境中进行水浴，水浴时间分别设定为5、10、20、30min，然后分别记录其对鼠伤寒沙门氏菌所表现出的抑制效果。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽抗菌活性的测定

2.1.1 抗菌肽的抗菌活性效果

经过仔细对比，同浓度下抗菌肽PR-39的抑菌圈的直径长度发现，如图1所示，图（a）直径长度约11mm，图（b）直径长度约为12.6mm，图（c）直径长度约为14.6mm，说明抗菌肽PR-39的抑菌效果确实明显。金黄色葡萄球菌加入抗菌肽PR-39的抑菌效果如图2所示。

图1 鼠伤寒沙门氏菌标准菌株

图2 金黄色葡萄球菌标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌加入抗菌肽（A表示2mg/ml的氨苄霉素，P表示2mg/ml抗菌肽产品PR-39，水是阴性对照）

2.1.2 PR-39最小抑菌浓度的测定

采用2-10～2-1mg/ml10个浓度梯度，运用二倍稀释法，结果发现第1～5孔中的菌液变得清澈透明，第6～11孔中菌液浑浊，所以鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度为2-5mg/mL，试验结果如图3。

图3 最小抑菌浓度测定试验

2.2 抗菌肽产品热稳定性的测定

完成各种浓度药液配置之后，将溶液置于99.2℃的沸水环境中进行水浴，水浴时间分别设定为5、10、15、20、30min，然后分别记录其对鼠伤寒沙门氏菌所表现出的抑制效果。具体可以观看图4。分析了解到，水浴分别为5、10、15min时，抗菌肽所表现出的抗菌效果是较为突出的，抑菌圈相对偏大。而在水浴20、30min时，虽仍存在有抑菌圈，但很明显抑菌圈变小。这意味着，抗菌肽产品在高温条件下仍可以发挥作用，但随时间增加，其对鼠伤寒沙门氏菌的抑制性能有所减弱。

图4 不同温度对抗菌肽产品抗菌活性的影响

3 讨论

3.1 抗菌肽产品抗菌性能和最小抑菌浓度

依据试验观察可知，该抗菌肽产品具备相当好的抗菌性能，对鼠伤寒沙门氏菌表现出十分优秀的抑制性能，而对于金黄色葡萄球菌而言，其抑菌圈并不显著，这也表明，这两种细菌对抗菌肽产品的敏感性是存在着明显差异的。本次试验是用双层琼扩法测出抗菌肽PR-39在浓度为2mg/ml时对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌都具有抑菌性，但对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果较好。随后以鼠伤寒沙门氏菌为试验菌做抗菌肽PR-39最小抑菌浓度测定，试验结果最小抑制浓度表现为10-5mg/ml。在对多种指标进行全面考虑的基础上，可以将10-5mg/ml界定为最佳浓度。该浓度标准不仅可以降低抗菌肽产品的应用量，还可以有效保障抗菌效果达到预期。彭荣在分析过程中，通过粉纹夜蛾离体细胞对抗菌肽性能作了进一步分析，其试验发现，这类抗菌肽的抗微生物活性相对较广，抑菌活性较为突出，尤其是针对植物病原真菌中的小麦赤霉病菌、花生白绢病菌，革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、沙门氏菌，酵母菌的白色念珠茵等作用突出。在这些抑菌活性中，效果最佳的是白色念珠菌、大肠杆菌，其次则是金黄色普通球菌，其他菌种效果偏弱。在2008年，刘慧明等人针对鲎抗菌肽作了深入的试验与分析，发现其对枯草杆菌、隐球菌有着十分突出的抑制作用，但分析也发现，该类抗菌肽对于变形杆菌没有作用。此外，更多的分析与大量的数据也表明，抗菌肽种类不同，在实际应用中的抗菌性能也表现出一定的差异，且所对应的最小抑制浓度也并不一致。从抗菌机理的视角来阐释，即抗菌肽可以对细菌质膜结构作出改变或破坏，继而引起膜穿孔，从而生成溶质通道或离子，促使细胞内容物大量渗出，继而让细菌失去活性并死亡，也可以对细菌的呼吸进行抑制，或阻碍细菌蛋白质的合成等。

3.2 温度对抗菌肽产品抑菌活性的影响

许兵红等在深入分析之后了解到，对于果丝光绿蝇幼虫，选择应用针刺诱导的方式获得抗菌肽，然后在100℃沸水中进行一分钟水浴，此时其仍存在着良好的抗菌活性，但在水浴持续三分钟时间后，其活性会丧失。如选择在80℃与60℃水温中进行水浴，持续五分钟后仍存在着抗菌活性。这也表明，该类抗菌肽抑菌活性存在着一定热稳定性，温度不同，热稳定性也存在着变化。针对稻蝗抗菌肽、乳酪蛋白来源抗菌肽也做了相应的分析，发现温度过高，也会导致其抑菌效果下降。在本分析中使用的抗菌肽PR-39，通过高温处理仍存在着较好作用，表明其热稳定性较为优秀。在100℃沸水中进行水浴，持续30min依然对鼠伤寒沙门氏菌表现出突出的抑制性能，但超出30min后，其抗菌圈已是十分小，且周围分布有细菌，这也意味着其抗菌性逐渐丧失，这些研究成果与以上学者分析结果一致。

3.3 抗菌肽PR-39的抗菌机理

对于细菌本身而言，其存在着细胞壁与细胞膜，这也会对抗菌肽构成抵抗力，细胞中的脂多糖在抵抗抗菌肽中发挥着突出作用，为此，在应用中需要思考采取一定的方法，将革兰氏阴性菌脂多糖净负电荷减少，这样便可以降低脂多糖的抵抗作用。抗菌肽抗菌机理的分析较多，主要表现为：其一，对细菌呼吸作用进行抑制处理，继而引起线粒体空泡化、肿胀与排列不规则，导致核膜缺乏界限，引起细胞内容物流出；其二，对细胞壁合成进行抑制，即抑制细胞正常生长，促使细胞壁穿孔，继而让细胞死亡，但这种方式对已存在的细胞壁不发挥作用[10]；其三，穿模，即对细胞内结构或膜进行破坏；其四，对蛋白质合成进行抑制，即降低蛋白质合成，抑制细胞正常生长。几乎所有的抗菌肽都是阳离子型，大多具有α螺旋和/或两亲β折迭结构。由于PR-39杀死正在生长的细菌比处于非生长状态的细菌要快的多，所以PA-39的杀菌机理可能是通过阻断细菌蛋白质和DNA的合成而杀灭细菌。因抗菌肽分子α-2螺旋存在着两亲性特征，为此，在抗菌肽分子聚合的过程中，会生成一定的离子通道，继而引起阳离子向外流动，从而让细菌防护丧失，无法维持正常的渗透压，从而促使细菌死亡。

4 结论

通过一系列的试验与分析可知，抗菌肽PR-39特性主要表现为：①抗菌性能显著，特别是对鼠伤寒沙门氏菌，有着优秀的灭杀效果，对于金黄色葡萄球菌也存在着一定的抑制性，对鼠伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度为10-5mg/ml。②热稳定性较为突出，在高温环境中持续5～15min时，其抗菌活性仍较为显著，但随时间延长，活性会逐渐下降并最终丧失。