动物狂犬病的研究进展

洪都孜·波拉提 吴建勇 古努尔·吐尔逊 穆妮热·喀迪尔 钟 旗*

(1.新疆农业大学,动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830013)

狂犬病（Rabies）是狂犬病毒所致的急性传染病，多见于犬、狼、猫等肉食动物，人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。因恐水症状比较突出，故本病又名恐水症（Hydrophobia）。动物通过互相间的撕咬而传播病毒。我国的狂犬病主要由犬传播，家犬可以成为无症状携带者，所以表面“健康”的犬对人的健康危害很大。对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率接近100%，患者一般于3～6 d内死于呼吸或循环衰竭，故应加强预防措施。

1 病原学

1.1 狂犬病病毒结构和分子生物学特点

狂犬病病毒属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus，LV），外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。

已发现的LV除4种未分型外，其他分属7个基因型，在欧洲大陆已发现了IRKV、WCBV和基因Ⅴ、Ⅵ型LV分布。该属包括了12个已定种和2个暂定种，除RABV外其他种的病毒统称为（rabiesrelated virus，RRV）。RABV基因组为单股负链不分节段RNA，全长约为12 kb。RABV五个结构基因编码5个结构蛋白，分别是核蛋白（nucleoprotein，N），磷蛋白（phosphoprotein，P），基质蛋白（matrix protein，M），糖蛋白（glycoprotein，G）和病毒依赖的RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，L）。L蛋白为最大结构蛋白，是一种多功能酶，主要负责病毒基因组复制、转录及转录后的加工。M蛋白为最小结构蛋白，是一种连接蛋白，在核衣壳和囊膜之间起着相互作用，并将两者连接在一起，可直接影响G蛋白构型。目前研究发现，M蛋白似乎与宿主对狂犬病的免疫反应有关。

1.2 病毒的理化特性

Carnieli等[7]报道，狂犬病病毒不稳定，但能抵抗自溶及腐烂，在自溶的脑组织中可以保持活力7～10 d。对神经组织较强的嗜性是狂犬病病毒的主要特征，与其他组织细胞相比，狂犬病病毒在神经组织细胞中繁殖和复制的效率极高。狂犬病病毒对紫外线，日光，热，干燥敏感，对其抵抗力较弱，一般加热50℃ 1 h或加热60℃ 5 min即可杀死病毒，该病毒对强酸，强碱敏感，容易被灭火。同时狂犬病病毒对甲醛，乙酸，碘，肥皂水，20%乙醚，10%氯仿以及离子型和非离子型去污剂均敏感，可灭火病毒[8]。病毒在冻干条件下可以长期存活，在50%甘油中保存的脑组织病毒至少可以存活一个月，4℃保存数周，低温中保存数月至数年，室温中保存不稳定。反复冻融可使病毒灭活，紫外线照射、蛋白酶、酸和季铵类化合物（如新洁尔灭）、自然光及热等都可迅速破坏病毒活力。真空条件下冻干保存的病毒于4℃存活可达数年。

2 流行现状

作为一种古老的人兽共患病，狂犬病在世界范围内广泛存在。2013年，世界动物卫生组织（OIE）调查显示目前有150个国家和地区报道过狂犬病的流行，仅有部分发达国家和地区的岛屿没有狂犬病报告，每年55000多人死于狂犬病。我国作为狂犬病高发国家，每年有上千人死于狂犬病，狂犬病发病和死亡人数居于世界第2位，仅次于印度。在 20 世纪，人类在与狂犬病的斗争中取得了重大胜利，90 年代北美地区死于狂犬病的人数降至个位数[12]，欧洲各国 除俄罗斯外，狂犬病发病率也控制到每年 1～2个的水平，甚至有些国家多年都没有出现过狂犬病疫情。中国在狂犬病 防治上也取得了巨大进步，虽然疫情有所反复，但总体呈现 下降趋势，2017 年共有 502 人死于狂犬病，远低于 2007 年的3300 人。如图2所示。基于此，2015 年 12 月，世界卫生组织、世界动物卫生组织、联合国粮农组织和全球狂犬病控制联盟合作启动了到“2030 年实现人类狂犬病零死亡” 全球框架。

图2 近十年中国死于狂犬病人数统计

目前感染犬是我国人和动物狂犬病最主要的传播来源，其中95%人狂犬病均是由患病犬咬伤、舔舐破损皮肤所致。病毒在体内典型的感染过程是由唾液中带有狂犬病毒的疯动物咬伤，使病毒从口侵入机体内。在侵入部位一般不增生，也不侵入血液，故无病毒血症。狂犬病毒从入侵局部进入周围神经组织内，沿着神经向心性传递至中枢神经系统。

我国狂犬病主要分布在人口密集的南方地区，其次为东部地区，东北和西部省份狂犬病疫情较少发生。我国流行毒株分为4个进化群，即亚洲1群、亚洲2群、北极相关群和世界群。亚洲1群分布最广，在我国中部和东南部的22个省份流行；亚洲2群在我国东南12个省市流行；北极相关群主要在内蒙古传播流行；世界群毒株在我国散在分布，其分支世界群草原型毒株主要在新疆和内蒙流行。新疆，狂犬病的主要传播来源是狐狸、狼等野生动物，2012年起该省出现多起野生狐狸引发家畜狂犬病的报道，该群毒株属于世界群草原型。

3 诊断检测技术

3.1 病原学诊断

3.1.1 病毒分离

首先采集动物或患者死后的新鲜脑组织或甲醛固定的脑组织，脑干要包含在采集的脑组织混合物中，将采集到的病毒标本进行冷冻保存。病毒分离方法有两种，一种是采用乳鼠体内接种法，即在乳鼠体内接种脑组织悬液，采用免疫荧光技术对乳鼠脑组织进行检测，此方法时间较长，需25 d后方可获得结果，且费用较高。另一种是细胞培养法，即采用鼠神经细胞瘤细胞进行细胞培养，培养1～2 d，然后采用免疫荧光技术对狂犬病毒内基氏小体进行检测。

3.1.2 荧光抗体检测（FAT）

荧光抗体检测荧光抗体检测（FAT）是OIE推荐用于检测狂犬病病原的技术之一。FAT可用于检测压印片、细胞培养物及小鼠脑组织中的病原。Muhamuda等[20]报道，FAT的检测原理是发光抗体与抗原相结合后，在紫外线照射下，用显微镜检查荧光素的有无来判断被检样品中的病原。FAT技术的优点是步骤简便、耗时短、敏感性强，适用于检测新鲜病料、甘油保存样品及被甲醛固定的标本，病原检出率大于99%。

3.1.3 乳鼠接种试验

将采集的脑组织（病动物的大脑皮层、海马或小脑、延髓等组织）匀浆悬液与含抗菌素的等渗缓冲液配成20%（W/V）溶液，待过滤后进行乳鼠脑内接种，最后利用荧光抗体实验对死亡鼠进行狂犬病毒检测。动物接种试验的优点是可以收获大量的病毒，用于毒株的保存及后续鉴定工作，缺点是这个试验必须使用SPF动物，试验成本高，不适用于大规模检测工作。

3.2 血清学诊断

3.2.1 荧光抗体病毒中和试验

荧光抗体病毒中和检测试验（FAVN）是将抗体血清与狂犬病病毒在体外中和，然后接种BHK-21细胞或C13细胞，测定血清抗体100%中和病毒及血清滴度在50%以上就能中和病毒时的血清稀释度。原始的FAVN方法已被改进，目前常用的方法为96孔微量板定量法。

3.2.2 快速荧光灶抑制试验

RFFIT是WHO狂犬病专家委员会推荐的标准方法，常用以评价RABV中和抗体的含量。抗体水平是监测中枢神经系统免疫反应的重要工具。该实验是让血清进行三倍系列稀释检测，将狂犬病毒与预先滴定过的中和进行等量混合，需在37℃温度条件下中和1 h，然后将96孔E接种形成单位的BSR细胞，再在37℃下的CO2孵箱中培养1 d，并将其固定同时进行荧光抗体染色，最后用荧光镜观察并将荧光灶数记录好，然后根据该数量计算血清抗体效价。

3.3 分子生物学诊断

该诊断方法主要是通过逆转录-聚合酶链反应直接扩增病毒株特异而保守的N基因。逆转录-聚合酶链反应有两大特点，一是灵敏度极高，二是特异性极高；其在大规模样品的初步筛选中是无可替代的，且检测结果直观，容易判定。不过其结果也会受非特异性序列变异、病毒稀释间接性、样品采集时间、样品类型等影响，所以其试验结果仅供参考，不可作为确诊依据。

4 疫苗

狂犬病疫苗已经有上百年的发展历史，法国科学家巴斯德早在1885年就制备出了世界上第一支狂犬病疫苗，首次用于人体并成功预防了狂犬病。狂犬病疫苗的研究一直是狂犬病防控技术研究中的一个最重要组成部分。狂犬病疫苗的研究主要经历了3个阶段，通过感染组织或感染鸡胚等方法制备的组织疫苗，为第一代狂犬病疫苗；通过人工感染体外培养的细胞制备的弱毒疫苗或灭火疫苗，成为第二代疫苗；通过分子生物学技术制备的疫苗为第三代疫苗。

4.1 神经组织疫苗

最早的狂犬疫苗是利用动物的神经和脑组织制备的，因此称为神经组织疫苗。1885年路易·巴斯德成功地利用神经组织疫苗挽救了一名被疯狗严重咬伤的儿童。神经组织疫苗免疫同时也具有强烈的毒、副作用，后来虽然有所改进，但仍能致人瘫痪甚至死亡。WHO于1984年建议停止生产和使用这类疫苗。

4.2 禽胚组织疫苗

1956年以后又成功的利用鸭胚研制出禽胚组织疫苗，这种疫苗多数用于暴露前的免疫，产生中和抗体水平较脑组织疫苗低，偶有神经系统并发症的发生[27]。1980年瑞士Berna厂用化学提取和区带离心纯化技术生产出一种鸭胚纯化疫苗，接种后与二倍体疫苗产生的抗体水平相当，不良反应很轻，但产量较低，应用量很少。

4.3 细胞培养疫苗

20世纪60年代以后细胞培养疫苗的制备技术得到较大发展，主要有地鼠肾细胞培养疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗、Vero细胞疫苗和人二倍体细胞疫苗，目前国内外广泛应用的狂犬疫苗为这类疫苗。

5 结语

狂犬病是一种呈世界分布的自然疫源性疾病，及时准确的诊断是控制狂犬病流行的有效方式。目前，全球仍有大约150个国家或地区中有狂犬病流行，有30余个国家和地区消除了由犬类传播给人类的狂犬病。但在中国，狂犬病仍是困扰公众的一个公共卫生威胁。偶尔有媒体报道有个别患者注射了疫苗仍发作狂犬病，造成了一定范围的恐慌，所以我们得重视对狂犬病疫苗的监督，研制出更有效果的更好的疫苗，正确认识狂犬病有助于控制狂犬病的传播。