浅谈非洲猪瘟实验室检测的注意事项

陈小丽

(三明市农业局,福建三明 365000)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，又称非洲猪瘟疫或疣猪病。临床以高热、食物废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为特征，没有特效药，没有疫苗，所以一旦发现必须扑杀并无害化处理。我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，是烈性外来疫病，严重危害着全球养猪业。

非洲猪瘟缘起非洲，1921年，非洲东部的肯尼亚首次确认非洲猪瘟疫情之后，陆续蔓延至欧洲、南美洲、欧亚交界处的欧洲地区。2018年8月3日，国家参考实验室确诊沈阳市沈北新区发生中国第一例非洲猪瘟疫情。不到一年时间，非洲猪瘟疫情已经覆盖了全中国，农业部也及时采取了各种措施来防控非洲猪瘟。而实验室检测成为防控非洲猪瘟疫情中一个非常重要的手段。无论是农业农村119公告强调生猪点对点调运的非洲猪瘟检测工作，还是农业农村部关于加强屠宰环节非洲猪瘟检测工作的通知等等都强调了实验室非洲猪瘟病原PCR的检测对非洲猪瘟防控的重要性。

1 非洲猪瘟样品的采集和送检

生猪点对点检测主要是采集生猪的抗凝血。采用装有抗凝剂的负压管，前腔静脉采集5ml的血液，颠倒混匀。如条件允许，最好每份血液样品采集2管，以便留存充足的备份样品。猪肉产品的调运检测主要采集猪肉组织和猪内脏。用采样杯采集不同部位的猪肉组织和猪脾脏、淋巴结等内脏组织。所有送检的样品都必须用病原专用密闭容器密封、固定，置于装有冷却用品的容器中迅速送检。

2 实验室诊断

非洲猪瘟是外来病，2018年8月第一次在中国确诊发生，而且疫情来势凶猛，传播速度惊人。中国动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位共同组成评价专家，于2018年11月26日至12月19日开展了非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作。农业农村厅办公室于2019年1月份公布第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂评价结果的通知（农办牧（2019）3号）。传统的病原PCR检测需要对样品的核酸进行提取，快速检测试剂均为免提取试剂盒，不需要对样品进行核酸提取，只需要对样品做简单的处理便可进行扩增检测，极大的提高了工作效率。

3 实验室污染的控制措施

生猪点对点调运实施点对点批批检，检测数多，任务重。市级实验室每天平均检测一千份左右，且实验室基本每天都在运行。长期大数量的检测，严重威胁了实验室的生物安全。很多实验室经过一段时间持续的检测后，出现了环境污染的问题。阴性对照出现特异性的扩增，导致结果无法判断。下图是三明市某县兽医实验室做非洲猪瘟样品时的扩增结果。

从图片信息可知，阳性对照扩增曲线正常，阴性对照出现扩增曲线，65个未知血样有14个样品出现扩增曲线。追溯样品，来源于3个养殖企业，目前该养殖企业的猪各类指标正常，没有疑似非洲猪瘟的临床症状。结合实验室情况，该实验室最近接收大量的非洲猪瘟生猪血液检测样品。由于任务繁重，人员不足等问题，该实验室每做完一批非洲猪瘟样品，仅对实验室进行简单的桌面擦拭和紫外消毒。

综合各类因素，该实验室先保存好样品，然后进行一个实验室的“大扫除”。首先，先把实验桌面，冰箱，废物桶等各类实验废弃物整理出实验室进行无害化处理。接着用10%的次氯酸擦拭耗材包装袋、实验台面、荧光定量PCR的放样孔和其他的台面。实验室地面用次氯酸钠拖洗两遍。然后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面，实验设备如加样器等需高压消毒处理，最后开通风设备通风半天。

为了保证实验人员的安全及防止有潜在传染性样本的散播，样本处理操作应该在生物安全柜中进行。

此图为实验室彻底消毒以后，重新对65个样品进行非洲猪瘟病原PCR检测，结果只出现一条阳性对照扩增曲线，阴性对照未出现特异性扩增，65 个未知样品均未出现特异性扩增。由此可见，实验室的污染导致了前一次14个样品的假阳性。

为了避免实验室的再次污染，日常检测过程中需要注意几点。第一、实验室要进行分区。基因扩增检验实验室原则上分为三个相对独立的工作区域：（1）标本制备区、（2）反应混合物配制区、（3）扩增产物分析区。工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从标本制备区、扩增反应混合物配制区至．扩增及扩增产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。每个区域都有固定的仪器和设备，不同局域的物品不得交叉使用。第二、要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管，特别是质控阳性对照极易污染环境，需要最后加样，加样时特别小心避免气溶胶产生引起交叉污染。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始标本、提取中的标本与试剂的混合液等）如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。

非洲猪瘟实验室检测已经成为防控非洲猪瘟的重要工作之一，实验室准确的诊断结果对非洲猪瘟的防控起到了重要的作用。农业部119公告里强调生猪点对点调运实行批批检的政策，加重了各级兽医检测部门的工作量。检测样品越多，实验室就越容易造成污染。为了避免实验室检测过程中假阳性或者假阴性的出现，实验室检测非洲猪瘟一定要规范操作。符合农业部相关的规定，检测过程中严格按生物安全手册的相关规定操作，保证能够及时、准确的得出检测结果以便指导生产、为疫病的防控提供科学的依据。