东北地区狐源大肠杆菌磺胺类耐药基因的检测与分析

鞠明霖 柴 荣 冯子轩 张 喆 薛 原

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

中国的狐类动物养殖产业已有较长的历史，目前还在不断地发展之中，由于气候、笼舍建设、环境条件以及预防卫生措施等问题，狐大肠杆菌引起的疾病发生频繁，对狐类动物的养殖有极大影响。因大肠杆菌(Escherichiacoli)能遗传抗生素的耐药基因[1]，其耐药基因的研究更成为人们关注的热点。国内外关于禽源、猪源、牛源等食品动物源大肠杆菌耐药基因检测的研究较多，而对于狐类动物的大肠杆菌耐药基因的研究报道很少。

磺胺类药物在抗细菌、抗真菌、抗癌、抗寄生虫、消炎镇痛、抗病毒、抗惊厥等多个医药领域显示巨大开发价值[2]。在前期已对大肠杆菌进行药物敏感性检测的基础上，本研究随机采集了涵盖黑龙江、吉林、辽宁三省多个狐养殖场的156株样本，针对狐源大肠杆菌对磺胺类药物的耐药基因进行检测和分析，了解东北地区狐源大肠杆菌对磺胺类药物的耐药情况，为实现狐类养殖中科学合理用药、有效防治疾病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

从黑龙江、吉林、辽宁部分狐养殖场采集样本，并运回实验室进行细菌分离培养，经分离鉴定，共有156株大肠杆菌。

1.1.2 仪器

PCR仪德国Biometra公司产品、凝胶成像分析系统美国Alpha Imager 2200公司产品。

1.1.3 试剂

Buffer、dNTP、rTaq、DNA Maker、TaqMix等购于宝生物有限公司。

1.1.4 引物合成

参照Sunde和Norström[3]合成sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ磺胺类耐药基因的引物。

1.2 方法

1.2.1 耐药基因的PCR扩增

PCR反应体系：取156株样品进行体系配置。25 μL反应体系配置如下：Buffer加入2.5 μL，dNTP加入2.0 μL，上游、下游两条引物各加入0.5 μL，去离子水加入18 μL，rTaq加入0.25 μL，样品DNA模板加入2 μL。将体系摇匀后放入PCR仪器中进行扩增。

PCR反应过程：95℃下进行预变性5 min，94℃开始变性1 min，退火45℃ 1 min，72℃下延伸1 min，循环35次，最后一次72℃下延伸5 min，4℃预冷3 min。

1.2.2 PCR产物的检测

将PCR扩增产物放入1%琼脂糖培养基中进行电泳，使用GoldVlewⅠ型核酸染色剂进行染色，将电泳结果放在凝胶成像分析系统中观察，并将实验结果拍摄。

2 结果与分析

2.1 PCR产物电泳结果

以狐源大肠杆菌的DNA为模板进行PCR扩增，得到的sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳，获得预期长度的电泳条带，部分结果见图1，图2，图3。

图1 耐药基因sulⅠPCR产物电泳结果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐药基因Fig.1 Electrophoresis results of sulⅠ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance genes of some strains

图2 耐药基因sulⅡPCR产物电泳结果M.Marker 2000；1—5.部分菌株耐药基因Fig.2 Electrophoresis results of sulⅡ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-5.Drug resistance genes of some strains

图3 耐药基因sulⅢPCR产物电泳结果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐药基因Fig.3 Electrophoresis results of sul Ⅲ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance

2.2 磺胺类耐药基因检测结果与分析

狐源大肠杆菌的样本共有156株，经PCR扩增和产物的检测，得出检测结果见表1。其中156株样本中磺胺类药物的耐药性耐药基因sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ均有测出，分别为19.23%(30/156)、44.87%(70/156)、20.51%(32/156)。此结果还具有明显的地域差异：在黑龙江的93株样本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的检出率分别为25.81%(24/93)、45.16%(42/93)、29.03%(27/93)，在吉林的24株样本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的检出率分别为16.67%(4/24)、91.67%(22/24)、8.33%(2/24)，在辽宁的39株样本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的检出率分别为5.13%(2/39)、15.38%(6/39)、7.69%(3/39)。

表1 156株狐源大肠杆菌磺胺类耐药性统计Tab.1 Statistics of sulfonamide resistance of 156 strains of fox-derived Escherichia coli

3 讨论

大肠杆菌是一类普遍存在于自然界，并能引发人和动物共同感染的轻微或严重的人畜共患病病原。根据养殖场的卫生条件、管理水平、用药习惯，养殖动物的患病情况也各不相同，如成年母畜感染大肠杆菌常引起流产和死胎，给养殖业带来较大经济损失[4]。

磺胺类药物具备抗菌谱广、价钱低廉、化学性质稳定、应用便利等长处，能抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌，是常用的抗菌药物，也是广泛使用的抗生素。其抗菌机理是干扰细菌的叶酸代谢，使细菌的生长、繁殖受到抑制。磺胺类药物常用来预防和治疗狐类等毛皮动物的部分疾病，但如果被长期或过量等不当使用，则会导致耐药菌的产生或其耐药能力的增强，从而减弱磺胺类药物的药效，影响疾病防治效果，甚至对养殖造成不可估量经济损失。此外，磺胺类药物在水体中的残留可对公共健康构成潜在威胁[5]。

根据磺胺类药物耐药基因的检测结果可见，黑龙江地区的狐类对磺胺类的药品耐药性总体上要略高于其他两个地区，已经呈现出较严重的耐药性。但其检出率仍低于其他地区的牛[6]、兔[7]、禽类[8]等养殖动物。由相对较低的检出率可推测出在东北地区狐类毛皮动物的养殖过程中对磺胺类药物的投喂时间较短或药量较少。目前东北是中国狐类毛皮动物养殖的主要地区，但将狐类作为经济动物进行规模化养殖时间相较禽类、猪、牛等短，只有近几十年的历史，这可能是本次实验检出率低于其他动物的主要原因。我们可以通过联合用药、加强饲养管理、保证用药的疗程与药量、尝试使用新型兽药等途径，尽可能减少饲养动物对某一药物的耐药性。从东北地区养殖狐狸分离得到的大肠杆菌为对象，对其磺胺类药物的耐药基因进行了检测分析，该结果可为狐类养殖过程中临床合理用药提供有力的参考依据。