运输对圈养大熊猫应激影响初探

唐 丹 杨 波 张志忠，3 王 一 朱 涛 吴代福林冰森 周季秋 瞿桂丽 李登翯 黄 炎*

(1.中国大熊猫保护研究中心，都江堰，611830；2.大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，都江堰，611830；3.国家林业和草原局野生动植物保护司，北京，100714；4.沈阳森林动物园管理有限公司，沈阳，110164)

近年来动物应激成了野生动物保护的研究重点，是动物健康和福利的重要指标。应激过大会对动物造成免疫系统、生殖能力以及生长发育等方面的影响[1]。因此，针对不同的刺激源，研究动物对其的应激反应大小，是动物保护工作重要的一环。运输应激作为其中一种应激因素，在圈养野生动物中发生频次较多，但却缺乏系统而全面的研究[2]，主要集中在亚洲象(Elephasmaximus)[3-4]，虎(Pantheratigris)[5]、野马(Equuscaballus)、斑鬣狗(Crocutacrocuta)[6]等的研究上。

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)作为中国特有的重点保护物种，对其应激源的研究主要集中在热源[7-8]，游客干扰[9]，麻醉[8]，噪音[10-11]、光照[12]、环境[13]等方面，并未见运输应激相关的研究，而实际的饲养管理工作中，如繁殖配对，大熊猫旅居海外，放归转运等，都需要运输大熊猫。因此，研究长途运输对于大熊猫应激反应具有实际意义。

1 研究对象

研究对象为19只大熊猫(16♀，3♂)，运输工具为汽车且运输时间均在2 h以上，装载笼箱长126 cm，宽65 cm，高74 cm。根据年龄将研究对象划分为2组：Ⅰ：0—10岁，Ⅱ：10—20岁。实验期间健康状况良好。

2 研究方法

2.1 样品采集及预处理

从运输前7 d开始逐日采集每一只大熊猫个体的粪便样品，持续至运输后第10天，共计18 d。运输当天的粪便样品全部采集，运输前后的样品每日采集1次，采样时间集中在9：00—11：00，为避免样品污染，使用PE手套采集样品后立即放入样品密封袋，并详细记录名称、日期、时间和地点等信息。然后按个体分别放入-20℃冰箱保存。样品采集完毕后，用真空冷冻干燥机(ThermoMODULYOD-230)干燥粪便至恒重，揉碎后取粉末部分保存于-80℃冰箱中。

表1 研究对象的基本信息Tab.1 Basic information of the giant pandas in the study

2.2 皮质醇激素的提取与测定

2.2.1 皮质醇的提取

称取0.09—0.1 g粪便粉末放入10 mL 离心管中，加入5 mL 90%乙醇，震荡20 min，然后1 500 rpm离心20 min，取上清液并移入10 mL 试管，再加入5 mL 90%乙醇，重复震荡离心取上清液，将收集到的上清液置于30℃水浴中待乙醇完全挥发，加入3 mL无水乙醇，再次完全挥发后加入1 mL溶解液，充分震荡，再移入500 μL 离心管中，保存于-20℃ 的冰箱中待检测。

2.2.2 皮质醇的测定

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定待测样品中皮质醇含量。大致步骤为：将二抗(Sigma R2004-5 Anti-Rabbit IgG)包被至酶标板，配制标准品和稀释样品，并用洗液清洗过的包被酶标板，依次加入标准品、样品、酶免反应酶HRP以及抗体2，孵育90 min后取出洗板，加酶免反应底物TMB，显示反应30 min后，加入H2SO4终止反应，最后在酶标仪(BioTek Elx800)上进行读数。

2.2.3 数据分析

激素浓度表示为Mean±SE。经正态分布和方差齐性检验，激素浓度不遵循正态分布与方差齐性，故采用非参数检验法(Kruskai-Wallis test)。

3 结果

3.1 运输对大熊猫粪便皮质醇水平的影响

以运输前7 d(-7—-1 d)皮质醇浓度作为大熊猫体内皮质醇正常水平值(278.68±21.92)ng/g，与运输后皮质醇浓度做比较，统计结果表明，运输当天皮质醇浓度开始显著升高(667.64±114.57)ng/g，P=0.006，运输后第1天皮质醇浓度有所下降，第2天再次上升至(621.72±206.92)ng/g，P=0.006。第3天皮质醇浓度恢复至运输前水平(184.42±32.22)ng/g，P=0.533。(图1)。

图1 转运前后各时间段大熊猫个体皮质醇浓度变化Fig.1 Fecal cortisol concentrations of giant pandas for each time for block

从个体情况看，运输个体F13在运输后第一天皮质醇水平达到峰值(图3)，而运输个体F12则在运输后第二天达到峰值(图2)。

图2 个体F12转运前后各时间段大熊猫个体皮质醇浓度变化Fig.2 Fecal cortisol concentrations of F12 for each time for block

图3 个体F13转运前后各时间段大熊猫个体皮质醇浓度变化Fig.3 Fecal cortisol concentrations of F13 for each time for block

3.2 运输对不同年龄大熊猫粪便皮质醇的影响

比较2个年龄组间皮质醇水平变化情况，从图4中可以看出，第Ⅰ组(0—10岁)在转运当天到第2天皮质醇浓度明显升高(P<0.05)，而第Ⅱ组(10—20岁)运输后皮质醇浓度没有出现明显的升高(P>0.05)。

图4 转运前后各年龄组大熊猫个体皮质醇浓度变化Fig.4 Fecal cortisol concentrations of giant pandas between different age for each time for block

4 讨论

已有许多研究揭示了运输刺激对野生动物应激状态的影响。无运输经验的老虎在长途运输后的3—6 d皮质醇水平达到最高，约为运输前的4倍[5]。雄性斑鬣狗运输后的第3天皮质醇达到峰值，第4天恢复至正常水平[6]。雄性亚洲象经过近24 h的运输，皮质醇激素在2 d后达到峰值，增幅高达389%[3]。

不同物种运输应激情况有所不同，同一物种不同个体运输应激情况也有不同。在我们得到的数据中，每个大熊猫个体皮质醇水平变化情况也有不同，如运输个体F13在转运后第1天皮质醇水平增高至峰值2 260 ng/g(图3)，而运输个体F12在运输后的第2天皮质醇水平才达到峰值13 340 ng/g(图2)。而皮质醇到达峰值的时间不同，是由于我们检测的为粪便中的激素浓度，激素分泌后需随食物从消化道中排出，而不同动物个体肠道蠕动时间不同，导致激素峰值时间的不同。非洲象(Loxodontaafricana)的研究表明，一只亚成年非洲象在注射完促肾上腺皮质激素后，20—25 h后即可检测到粪便中皮质醇激素的峰值[14]，而一只老年非洲象在注射完促肾上腺皮质激素后，46 h后才能检测出粪便中的皮质醇激素峰值[15]。而理论上粪便中皮质醇浓度的变化会有一定延迟性，但我们检测发现运输当天皮质醇浓度便开始迅速升高，可能是由于运输当天粪便样品较多，多数样品采集时间跨度超过10 h，应激性强的个体在运输当天中后期激素就已升高。另外个别运输个体在运输前(工作人员准备转运笼等准备工作时)已受到惊扰，表现出一定应激性。

当考虑年龄因素时，第Ⅰ组(0—10岁)在运输后表现出了明显的应激性，而第Ⅱ组(10—20岁)运输后皮质醇浓度没有显著性的升高。我们分析这是由于第Ⅰ组的个体年纪较小且多数为首次运输，没有运输经验，对运输刺激较敏感，应激反应明显。而第Ⅱ组15岁以上的大龄熊猫较多，且它们中多数已有丰富的运输经验，运输不能造成明显的刺激作用。有研究表明动物有无运输经验会直接影响应激反应的大小[16]且动物通常对陌生的刺激源表现出更大的应激反应[17]。由于此次实验个体多为雌性大熊猫，无法体现性别因素对运输应激的影响。

尽管机体的应激程度分为3个不同的阶段[18]，内分泌活动的变化为第一个阶段，但运输后大熊猫皮质醇激素的显著升高足以说明运输激发了大熊猫体内应激机能的启动，这为以后深层次的大熊猫应激研究打下基础，同时为大熊猫的圈养保护工作提供了理论依据，在一定程度上指导实际的保护研究工作，比如，在每年的大熊猫繁殖季节，由于发情期间大熊猫身体状况的特殊性，应尽量减少对发情期大熊猫的运输，如特殊原因需要运输，最好提前一周进行运输，减少运输应激对大熊猫繁殖造成影响。在大熊猫野化放归研究中，为了避免大熊猫因为运输产生更严重的应激反应，也要减少运输，运输后保持安静等方法，保证大熊猫良好的身体状况，提高大熊猫放归后的存活率。