乌苏里蝮罹患间叶型软骨肉瘤研究

路生鑫 李丕鹏 王珊珊 姚晨昊 程建鑫 周正彦 陆宇燕*

(1.沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，沈阳，110034；2.青岛奥克生物开发有限公司，青岛，266111)

蛇，作为一种很少群居的生命体，在野外时常发现死亡的个体，但其死因很难鉴定。动物园是很多野生动物的乐园，有着良好的管理措施和详尽的记录。因此，目前关于蛇类的疾病报道大部分均来自于动物园的研究报道[1-2]。但随着蛇产品的不断开发，对蛇的需求也随之猛增。而国内大量的蛇类养殖场，最棘手的问题就是如何提高对蛇类疾病的预防和治疗。虽然已有很多养殖者和科研人员对蛇类疾病进行了普查、治疗和预防工作，但主要集中于蛇类的皮肤病、口腔炎、肺炎、肠炎，体表和体内寄生虫等方面[3-4]。关于蛇类肿瘤报道极少，国内仅见对圆斑蝰(Daboiarusselii)横纹肌肉瘤的报道，国外报道也不多见[5]。

乌苏里蝮(Gloydiusussuriensis)是东北地区常见毒蛇，由于其蛇毒具有特殊的药用价值[6]，野外种群近年来呈急剧下降的趋势。虽然国内已开展了探索人工养殖模式，以缓解对野外种群的生存压力，但在大规模高密度的饲养情况下，乌苏里蝮的生长情况并非理想，死亡率得不到有效控制。本实验室对人工养殖的乌苏里蝮健康情况做了初步调查，首先对已经表现出生长不良、体表有异物突起、蜕皮困难、喂食后吐食的个体进行了较为系统的解剖观察。本文对颈部有异常突起的乌苏里蝮进行系统检查，希望能更多地了解病况，积累一些相关疾病的基础资料，为后面的深入研究打下科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用乌苏里蝮，由沈阳斯纳可蛇类养殖有限公司提供，均为在饲养场喂养一年以上的成年蛇(健康蛇6条，具肿瘤蛇6条)。

1.2 方法

用乙醚将蛇麻醉后，首先进行体重、体长的测量(体重测量：Mettler ToledoQ/OAFA02—2009电子天平，精确度：0.1 g；长度测量：哈尔滨量具厂GB/T14899—94电子数显游标卡尺，测量范围150 mm，精确度0.01 mm)。尾静脉取血后，自泄殖腔处剖开腹壁进行大体解剖，观察各器官色泽和形态，称量相关器官以及蛇的胴体重量。尾静脉取血1.5 mL，离心(上海安亭科学仪器厂TGL-16G-C高速台式冷冻离心机)后取分离血浆，取血清送沈阳艾迪康医学检验中心进行相关指标的检测。尾静脉取血0.1 mL，利用BM21B半自动血细胞分析仪进行血细胞分类计数。解剖后剥离的器官和肿块均固定于10%的中性福尔马林溶液。常规石蜡切片(厚度7 μm)，分别进行HE(Olympus BX5显微镜和Olympus DP71摄像头观察拍照)和免疫组化染色。免疫组化采用EnVision二步法，DAB染色。S100、VIM、EMA和GFAP的免疫组化标记的操作步骤按说明书进行，所有抗体试剂购自沈阳鼎国生物技术公司。

1.3 计算公式

肥满度=蛇胴体重(g)×100/体长3(cm3)；

各器官系数=器官重量/蛇胴体重量。

1.4 数据分析

实验数据使用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，相关数据以平均值±标准差表示。设置P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2 结果

2.1 蛇瘤体描述

编号为F20160759乌苏里蝮颈部明显的隆起(图1a)。剖开颈部皮肤后，可见脖颈部有一大一小前后两个肿块，两者各自有独立的被膜包裹，肿块之间以及肿块与气管之间较易分离(图1b、1c)，但肿块与食道之间的剥离略显困难。肿块表面光滑，整体呈淡肉红，局部呈明显的淡黄色板块，可见有丰富的毛细血管分布于浆膜下。手触感觉肿块整体较硬，切面呈乳白色，隐约可见散在的小孔状结构。其他有肿瘤乌苏里蝮脖颈部不同程度存在着数个肿块(编号F20170101图1d)，但其体积明显小于前者(F20160759)，颜色均为乳白色，其他特征与前一条类似。

由表1可见，正常蛇与肿瘤蛇在肝系数和肾系数两种数据上无显著性差异(P>0.05)，在肥满度上正常蛇与肿瘤蛇呈显著性差异(P<0.05)，而在脂肪体系数上正常蛇和肿瘤蛇呈极显著性差异(P<0.01)。

图1 乌苏里蝮解剖图 a.F20160759乌苏里蝮颈部侧面观；b-c.F20160759颈部肿瘤腹面观及剥离状态；d.F20170101颈部肿瘤腹面观Fig.1 The anatomies of Gloydius ussuriensis a.The lateral view of F20160759 neck region.b-c.The ventral view and stripping state of the tomours in F20160759.d.The ventral view of the tomours in F20170101

表1 乌苏里蝮的一般形态学测量指标Tab.1 General morphological measurements of Gloydius ussuriensis

注：P≥0.05为不显著，*0.01≤P<0.05为显著，**P<0.01为极显著
Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01≤P<0.05 *show the data is significant different，P<0.01 **show the data is very significant

2.2 组织学观察

在肿块的整体横切面上可见，肿块浆膜较薄；没有被结缔组织间隔形成明显的“小叶”结构；在肿块的边缘可见小血管分布，但在肿块内部未见典型的血管结构。肿块内部可明显划分为2个区域：软骨区和病灶区即“癌穴”(图2a)。

2.2.1 软骨区

由组织学切片可见，肿瘤的大部分均由软骨组织构成(图2b)，可见正常的软骨陷窝，软骨囊深染，边界清晰，其中有2—4个软骨细胞。软骨细胞圆形或椭圆形，均呈收缩状态，大小仅为软骨囊显示的50%以下，其余软骨囊中充填或多或少的淡蓝紫色物质，或者呈空泡状(图2c)。软骨细胞胞质呈较强的嗜碱性，胞核深染、均匀，一般位于细胞中央，也有个别偏位。软骨囊的排列松散，相互之间甚至出现很大的空隙，而在空隙周围的软骨细胞成明显的皱缩或破裂(图2d)，并可见部分软骨陷窝边缘有增厚的蓝紫色区域。在少数区域有类似病变的毛细血管样结构，整个区间在HE染色中呈淡紫色，其间可见各种类型血细胞的核，而细胞质膨大淡染。在一些间隙中可见大量的淋巴细胞(图2e)或嗜酸性颗粒细胞的存在(图2f)。在一些区域软骨陷窝很少，可见有多数的胞核，胞质边缘模糊，含有较多的嗜酸性颗粒细胞，纤维成分明显，周边还有较多、较大的淡紫蓝的钙化斑块存在(图2f)。

2.2.2 癌穴

由图2a可见，有大小不一的圆形或椭圆形的癌穴分布其中，在肿块的横切面中其整体面积占肿块面积的20%—30%。这些癌穴的结构也不尽相同，依据与软骨组织之间有无明显的边缘结构，可初步划分为2大类：有界膜结构和无明显界膜结构，而这2种结构还可依据形态划分，以下分别叙述。

有界膜结构的“癌穴”形态呈规则的圆形(图2g)是最多见的类型，整体呈圆形，由界膜、外圈和核心3部分组成。“界膜”，由3—7层扁平细胞围成，其间有浸润的嗜酸性细胞；外圈，即靠近界膜的一个同心圆区域，由排列紧密而不规则细胞构成，细胞较构成界膜的细胞明显增大，越接近界膜处，细胞体积越大。而近核心处有较多的嗜酸性细胞存在。这些构成外圈的细胞界限较模糊，胞质弱嗜碱性，部分细胞胞质呈水样或脂肪变性。胞核较大淡染，染色质有边缘化分布的趋势，少量细胞可见核仁。核心，即“角化珠”是一个圆形或椭圆形的强嗜酸性区域，无典型的细胞结构，也非均质。核心与外圈部分常呈分离状。但个别“癌穴”的核心也有呈嗜碱性的区域，且多呈破损状或严重破损状。

有界膜结构的“癌穴”形态呈不规则的椭圆形(图2h)，较为少见，整体呈长梭型，界膜，中部分外侧区域出现了较多的纤维成份、嗜酸性细胞以及呈索状的蓝紫色嗜碱性“钙化线”。界膜内部一端有大量小细胞充斥，细胞圆形，界限不清，胞质弱嗜碱性，胞核大，染色质大多边缘化排列，核仁可见；另一端为圆形的一大一小癌穴外圈，癌穴核心或无或不典型，仅有少量的强嗜酸性物质。

无界膜结构的“癌穴”有角化珠的雏形(图2i)，界膜缺失，仅有癌穴外圈结构，在其中有散在的1—3个小型强嗜酸性斑块，即不典型的角化珠。

无界膜结构的“癌穴”卫星城角化珠(图2j)，界膜缺失，在癌穴边缘区域出现少量的不连续的扁平细胞和纤维成分围绕，癌穴的大部分仅由外圈成分构成，在中心区域虽有强嗜酸性物质累积，但仍以软骨组织为主。癌穴的边缘和近边缘处均可见嗜酸性粒细胞的浸润，并可见少量的细胞分裂相出现。

图2 乌苏里蝮肿块HE染色结果Fig.2 The HE staining of tumors in Gloydius ussuriensis 注：a-f.肿瘤横切；g.圆形有界膜癌穴；h.长梭形有界膜癌穴；i-j.无界膜癌穴；N.癌穴；CH.软骨细胞；WCC.皱缩的软骨细胞；L.淋巴细胞；CP.钙化斑；DBV.变性血管；EG.嗜酸性颗粒细胞；LM.界膜 Note：a-f.Tumor crosscutting.g.Circular of nest with limitans membrane.h.Fusiform of nest with limitans membrane.i-j.Nest without limitans membrane.N.Nest.CH.Chondrocyte cell.WCC.Wizened chondrocyte cell.L.Lymphocyte.CP.Calcified plaque.DBV.Degenerative blood vessels.EG.Eosinophilic granulocyte.LM.Limitans membrane

2.3 血细胞分类计数

由表2可见，肿瘤蛇的红细胞数和血红蛋白含量虽然均低于正常蛇，两者之间没有显著性差异(P>0.05)。肿瘤蛇的白细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞和中间细胞(主要指单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)均低于正常蛇，并均呈显著性差异(P<0.05)。其中，肿瘤蛇的中性粒细胞仅为正常蛇的57.38%。值得注意的是，肿瘤蛇的血小板数量仅为正常蛇的21.05%，两者之间呈极显著性差异(P<0.01)。

2.4 血清相关指标的检测结果

受检的K、Na、Cl和Mg 4种血清无机盐离子的含量，正常蛇和肿瘤蛇之间非常接近，均无显著性差异(P>0.05)。但肿瘤蛇血清中钙、磷含量均明显低于正常蛇，分别是正常蛇的82.51%和78.42%，均无显著性差异(P>0.05)，但钙磷乘积肿瘤蛇与正常蛇之间呈显著性差异(P<0.05)。碱性磷酸酶活性肿瘤蛇仅为正常蛇的46.1%，两者之间呈极显著性差异(P<0.01)(表3)。

表2 乌苏里蝮血细胞参数Tab.2 Blood cell parameter of Gloydius ussuriensis

注：P≥0.05为不显著，*0.01≤P<0.05为显著，**P<0.01为极显著
Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01≤P<0.05 *show the data is significant different，P<0.01 **show the data is very significant

表3 乌苏里蝮血清相关指标Tab.3 Serum index of Gloydius ussuriensis

续表3

注：P≥0.05为不显著，*0.01Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01

血糖含量，肿瘤蛇是正常蛇的187.04%，两者间呈显著性差异(P<0.05)，但与其相关的糖化血清蛋白含量肿瘤蛇虽略高于正常蛇，但无显著性差异(P>0.05)。

在血清中甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，肿瘤蛇均低于正常蛇，仅总胆固醇含量肿瘤蛇与正常蛇之间呈极显著性差异(P<0.01)，其他3项均无显著性差异(P>0.05)。脂蛋白含量肿瘤蛇与正常蛇者间呈显著性差异(P<0.05)。

总胆红素含量肿瘤蛇略低于正常蛇，间接胆红素含量肿瘤蛇略高于正常蛇，两者指标在肿瘤蛇与正常蛇之间无显著性差异(P>0.05)。直接胆红素含量肿瘤蛇高于正常蛇，两者间极显著性差异(P<0.05)。直接胆红素与总胆红素的比值肿瘤蛇是正常蛇239.2%。

心肌酶系包括a-羟丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶，肌酸激酶和肌酸激酶同工酶4项，这4种酶活性肿瘤蛇均高于正常蛇，其中仅a-羟丁酸脱氢酶活性在两者间呈极显著性差异(P<0.01)。 HBDH/LDH的比值肿瘤蛇高于正常蛇，两者间呈显著性差异(P<0.05)。

CA24-2(糖链抗原24-2)含量肿瘤蛇是正常蛇的216.14%，两者间呈显著性差异(P<0.05)；CA72-4(糖链抗原72-4)肿瘤蛇含量略低于正常蛇，两者间无显著性差异(P>0.05)。

2.5 免疫组化

对S100、VIM、EMA和GFAP的免疫组织化学标记结果显示，S-100在肿瘤中的软骨细胞中呈阳性，主要表达于胞质及软骨囊腔(图3a)，但在无界膜的癌穴中有大量大小不一的强阳性细胞分布(图3b)。VIM主要在肿瘤的边缘区域的间质细胞中呈阳性，尤其在角质珠为强阳性(图3c)，但在软骨细胞为阴性(图3d)。EMA在软骨细胞质膜为强阳性(图3e)，在软骨囊边缘也有阳性表达。GFAP在癌穴的基质呈阳性，但其中散在的软骨细胞为阴性(图3f)。在癌穴周边的软骨组织区域也有一些呈圆形或椭圆形的细胞呈强阳性(图3g)。

3 讨论

3.1 肿瘤性质的确定

对于爬行类肿瘤的研究主要来自对动物园圈养类型的研究，学者指出在圈养情况下蛇类患上肿瘤的几率要高于其他爬行类[1-2]。研究报道显示，玉米蛇(Pantherophisguttatus)是软骨肉瘤的易发者[5]。人类医学研究认为软骨肉瘤起源于胚胎时期软骨遗迹或是多能间叶细胞参与了肿瘤发生[7]。病理检测中将软骨肉瘤划分为普通型、透明细胞型、间叶型和去分化型四类。其中间叶型的恶性程度较高，且更易转移[8]。间叶型软骨肉瘤具有明显的双相分化特征，即由未分化原始间叶细胞和散在的岛状高分化的透明软骨构成。两种成分的比例于不同病例中即或同一病例中的比例均有差异。两种结构或呈过渡态混合在一起，或两者分界清楚。有的区域结构稀疏有大小不等的空隙出现，也有局部呈现渐进性肿瘤坏死。未分化细胞较小，呈圆形或梭形，排列紧密呈片状分布，细胞核呈多态性，染色质浓集深染，细胞质少。细胞分裂相极少见[9]。软骨区有典型的软骨基质及陷窝，软骨细胞有轻度异型性，可有不规则点片状钙化灶[9-10]。在人类和其他哺乳动物软骨肉瘤的研究中，选取S-100和VIM进行标记。S-100蛋白是一种酸性钙离子结合蛋白，主要分布在神经组织中的各类细胞，黑色素瘤细胞，脂肪细胞和软骨细胞[11]。VIM，即波形蛋白。是一种中间纤维，负责细胞中细胞器的分配和定位。多种上皮源性的肿瘤均可表达，且与肿瘤细胞的分化、侵袭和转移有密切相关[12]。对软骨肉瘤进行免疫组化观察研究的结果显示，软骨细胞呈S-100蛋白阳性，未分化间叶瘤细胞呈VIM蛋白阳性[8-9，13-14]。本研究报道的乌苏里蝮食道旁肿瘤的组织学结构特征和免疫组化的结构均于上述相关特征一致，因此可以确认进行病理研究的这几条乌苏里蝮罹患了间叶型软骨肉瘤。而EMA是上皮细胞胞膜上的糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞和癌细胞[15]；GFAP是星型角质细胞骨架蛋白的特有成分，它的表达与脑血管病、肿瘤及癫痫等多种疾病相关。也是神经源性的组织细胞的一个重要标记物[16]。而EMA和GFAP在乌苏里蝮的间叶型软骨肉瘤中的表达，进一步证实了软骨肉瘤具有上皮源性和神经源性的双重特点。

3.2 血栓细胞与肿瘤

大量研究显示，肿瘤细胞能够分泌含有RNA的外泌体，当其被释放进入血液后就会被血小板吞噬，从而改变血小板中的RNA水平。而血小板中的RNA是调节血小板功能的物质基础。更为重要的是在肿瘤环境中，血小板能够通过释放胞内物质促成肿瘤的恶性发展[17-18]。另外，血小板的数量的增加与结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤有着密切的关系[19]。然而，罹患间叶型软骨肉瘤的乌苏里蝮的血细胞计数结果显示，各类白细胞均低于正常蛇，两者间均有显著性差异(表2)。另外更加值得注意的是患病的乌苏里蝮的血栓细胞的数量肿瘤蛇仅为正常蛇的22%，两者间为极显著性差异。这个数据与人类医学研究的结果正好相反，是爬行类生理特征与人类之间的差异，还是其他因素导致，有待于积累病例深入研究。

3.3 血清指标与肿瘤

在动物疾病诊断中，碱性磷酸酶是反映骨改变全过程的重要指标，特异性、准确性和灵敏度均优于其他指标[20]。乳酸脱氢酶(LDH)同工酶中的羟丁酸脱氢酶(HBDH)与乳酸脱氢酶的比值(HBDH/LDH)有可能是肿瘤恶性转化早期的一个生化指标[21]，同时HBDH/LDH比值的升高也提示了心肌组织遭受了严重的损伤，而且其比值越高受损程度越严重[22]。罹患间叶型软骨肉瘤的乌苏里蝮的碱性磷酸酶低于正常蛇的活动，而HBDH/LDH的比值远高于正常蛇，这两个生化指标是否可以作为今后蛇病诊断的有意义的参数也是有待于进一步探究的。