乳腺癌组织及外周血纤维连接蛋白EDA片段基因拷贝数变异对乳腺癌转移的影响研究

郝晓妍 彭勋 任光辉

【摘要】 目的 研究对比乳腺癌组织及外周血纤维连接蛋白（FN）蛋白结构域A（EDA）片段基因拷贝数变异对乳腺癌转移的影响。方法 100例手术切除的乳腺癌改良根治术标本， 其中出现淋巴结转移50例作为转移组， 无淋巴结转移50例作为无转移组;另选取同期进行乳腺癌根治术切除标本癌旁乳腺组织（正常组织）50例作为对照组。对三组血纤维连接蛋白EDA片段基因进行分析， 观察并对比三组标本细胞株中FN基因EDA蛋白的表达及EDA片段FN mRNA相对表达量情况。结果 转移组阳性细胞率（93.3±2.4）%高于无转移组的（71.9±4.8）%和对照组的（5.4±1.1）%， 且无转移组高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。转移组mRNA相对表达量（2.75±0.70）高于无转移组的（1.74±0.44）和对照组的（1.00±0.02）， 且无转移组高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 FN基因EDA片段在乳腺癌的转移过程中起到了重要的作用， 其与癌细胞的转移潜能密切相关。

【关键词】 乳腺癌;外周血纤维连接蛋白;乳腺癌转移;蛋白结构域A片段

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.107

纤维连接蛋白是一种单基因编码组成的多功能糖蛋白， 其主要分布于体液及血浆中， 在细胞外基质以及细胞膜中也有少量分布[1]。有研究表明[2]， 其在肿瘤的转移和侵袭的过程中起到了非常重要的作用。随着研究的不断深入， 近年来医学界发现含有EDA片段的FN在肿瘤组织中呈现异常的高表达情况， 因此对于FN基因EDA的片段已经变成现如今肿瘤医学热议的问题[3]。本研究旨在探究对比乳腺癌组织及外周血FN EDA片段基因拷贝数变异对乳腺癌转移的影响， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2014年1月～2017年1月手术切除的乳腺癌改良根治术标本100例， 其中出现淋巴结转移50例作为转移组， 无淋巴结转移50例作为无转移组;另选取同期进行乳腺癌根治术切除标本癌旁乳腺组织（正常组织）50例作为对照组。

1. 2 纳入及排除标准

1. 2. 1 纳入标准 ①患者的预期生存期≥3个月;②无精神疾病， 有良好的治疗依从性;③患者经组织学确诊， 且符合国际抗癌联盟对于乳腺癌分期标准。

1. 2. 2 排除标准 ①存在脑部转移的患者;②妊娠、哺乳等特殊生理时期的患者。

1. 3 方法

1. 3. 1 标本采集 采集研究对象组织标本以及患者外周血3 ml。

1. 3. 2 脱氧核糖核酸（DNA）提取 采用美国Qiagen基因组DNA提取试剂盒， 严格按照试剂盒的说明进行DNA的提取。

1. 3. 3 DNA鉴定、定量 提取DNA样品后， 经1%琼脂糖凝胶电泳检测， 预估浓度和DNA降解程度。对于浓度过低或者讲解程度过高的样本， 重新提取DNA。用微量紫外分光光度计对所有DNA样本进行浓度测定， 并标记至10 ng/μl， 备用。

1. 3. 4 聚合酶链式反应（PCR）扩增 采用AeeuCopyTM多重基因拷贝数检测试剂盒进行PCR扩增。取2 μl DNA模板与2 μl内对照DNA混合液混匀后， 加入10 μl 2×PCR Master Mix， 1 μl多重PCR引物混合液以及5 μl双蒸水（ddH2O）。

1. 3. 5 纤维连接蛋白EDA片段基因拷贝数变异检测 取1 μl PCR产物稀释20倍后， 取1 μl与0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD， 8.5 μl HI-DI混匀， 95℃变形5 min后上AABI 3130XL DNA测序仪。根据每个基因的样本DNA/内对照DNA扩增产物长度及荧光标记信息， 利用GeneMapper 4.0对ABI3130XL测序仪生成的数据文件进行分析， 输出每个产物峰的峰高以及峰面积。输出结果采用Excel进行整理、统计和分析。

1. 4 观察指标 观察并对比三组标本细胞株中FN基因EDA蛋白的表达及EDA片段FN mRNA相对表达量情况。

1. 5 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

转移组阳性细胞率（93.3±2.4）%高于无转移组的（71.9±4.8）%和对照组的（5.4±1.1）%， 且无转移组高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。转移组mRNA相对表达量（2.75±0.70）高于无转移组的（1.74±0.44）和对照组的（1.00±0.02）， 且无转移组高于对照組， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一， 占女性恶性肿瘤发病率的首位， 其不只是局部肿瘤， 也是一种全身性疾病， 其远处转移是导致患者死亡的主要原因。血行转移是乳腺癌患者远处转移的一个主要途径， 通过血液循环的作用， 肿瘤细胞很容易转移到全身到达其他组织和器官。纤维粘连蛋白是细胞外基质的重要组成部分之一， 其广泛分布于血浆以及细胞外基质中。现代研究表明， 大多数正常组织细胞外基质中并不存在EDA-FN的表达， 且良性肿瘤中EDA-FN的表达也不明显。但通过增生旺盛的组织研究发现， 这类组织中EDA片段呈现异常高表达， 阳性表达的EDA-FN及其mRNA在恶性肿瘤周围反应区的间质中和肿瘤细胞内普遍呈现高表达， 说明该片段与细胞的迁移和增殖关系密切[4-6]。

国内外目前普遍认为， 恶性肿瘤中EDA-FN以及其mRNA存在明显的高表达， 但在良性肿瘤中并不明显， 且某些恶性肿瘤中的EDA-FN的表达程度与肿瘤的转移能力以及预后情况存在明显的相关性[7]。相关研究结果显示， 乳腺癌患者癌细胞核基质中的EDA+FN表达率分别为45%和69%。本研究结果显示， 乳腺癌无转移的患者表达率为（71.9±4.8）%， 大致与同类研究相符。此外， 在正常的乳腺组织中极少表达EDA-FN， 与之相反， 在分化不良或者有淋巴结转移的乳腺癌患者中EDA-FN的表达率更高。广义而言， 细胞的迁移是指细胞从其原本的位置迁移到另外一个位置， 而转移则指的是癌细胞脱离原发灶， 移动到其他的组织或器官， 并在所到处增殖形成另外一个肿瘤的过程。EDA能够促进肿瘤细胞的黏附以及转移， EDA-FN在淋巴管形成与发育中也起到了至关重要的作用， 且在胚胎的发生期间， EDA可以促进淋巴管生成中一些关键的因子比如转录因子Proxl、纤维状激动蛋白等， 从而促进淋巴管内皮细胞的出芽、迁移[8]。

本研究结果显示， 转移组阳性细胞率（93.3±2.4）%高于无转移组的（71.9±4.8）%和对照组的（5.4±1.1）%， 且无转移组高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。随着转移程度的逐渐加深， FN基因中EDA蛋白表达情况也越来越高。转移组mRNA相对表达量（2.75±0.70）高于无转移组的（1.74±0.44）和对照组的（1.00±0.02）， 且无转移组高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。三组标本EDA片段FN mRNA的表达量均有差异， 且随着转移程度的加深， 表达量也明显增加。

综上所述， FN基因EDA片段在乳腺癌的转移过程中起到了重要的作用， 其与癌细胞的转移潜能密切相关， 对于EDA的深入研究有望打开治疗肿瘤淋巴转移的新篇章。

參考文献

[1] 李娇. 利用QM-FISH技术分析EGFR与AKT1基因拷贝数与乳腺癌预后的相关性. 天津医科大学， 2015.

[2] 王海丞， 李翠英. 纤维连接蛋白EDA片段在肿瘤生长、转移过程中的功能研究进展. 口腔医学研究， 2007， 23（4）：456-459.

[3] 杨月， 王海丞， 彭靖， 等. 纤维连接蛋白EDA片段的病理学研究进展. 口腔医学研究， 2016， 32（5）：538-540.

[4] 金承龙， 金玟言， 金珊， 等. 中波紫外线对皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白及EDA、EDB表达的影响. 中国皮肤性病学杂志， 2018， 32（6）：18-21.

[5] 蒋瑞芳， 杨月， 李翠英. 纤维连接蛋白EDA片段与肿瘤相关细胞信号转导通路. 北京口腔医学， 2014（5）：288-291.

[6] 蔡晶晶. 纤维连接蛋白EDA片段功能及临床应用前景研究进展. 河北医科大学学报， 2016， 37（5）：617-620.

[7] 余松. 皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白及其EDA、EDB表达与损伤时间的关系. 法医学杂志， 2007（3）：188-190.

[8] 唐安明. 修饰的寡肽及其在分子影像和超分子水凝胶中的应用研究. 中国科学技术大学， 2015.

[收稿日期：2019-02-25]