镉暴露对背角无齿蚌鳃和消化腺的氧化应激

井维鑫，林子根，郎 朗，刘 娜，王 茜，王 兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

镉（Cd）主要毒性形式是镉离子（Cd2+），是淡水水生态系统中广泛和长期存在的、具有致癌作用的重金属污染物[1-2]。在我国多个湖泊（尤其是东部和中部湖泊）沉积物中，Cd 污染程度达到中度到重度，其潜在的生态风险系数最高[3]。Cd2+与钙离子（Ca2+）等必需金属离子竞争进入细胞[4]，可以诱导细胞内活性氧（ROS）的生成[5]。当机体内形成的ROS过多时，可导致细胞损伤，破坏细胞结构与功能，并诱导细胞凋亡或细胞坏死[1]。

软体动物双壳类由于种类、数量较多，广泛分布于世界范围内江河湖海之中，直接与水体和沉积物接触，且运动能力弱，还具有低代谢率、高滤水率和抗逆性强等特点[6]，是较理想的水体中Cd 等重金属污染的监测生物[5]。研究发现，当贝类受到重金属暴露时，其抗氧化系统可以起到消除ROS 的作用，可防止或减轻氧化损伤的发生[7]，对环境污染起到早期预警作用[8]。

背角无齿蚌（Anodonta woodiana）在我国分布广泛[9]，具有改善水质的作用和较高的经济价值[10]，其生长速度快，适应能力强，作为“淡水贝类观察”的指示生物，用于监测和评估淡水环境Cd 等重金属污染[11-12]。目前，就Cd2+致背角无齿蚌急性毒性的研究虽已有报道，但大多数检测生物标志物的种类不超过4 种[9，13-15]，且单个或少数几个抗氧化酶的测定，不足以说明完全的抗氧化防御[16-17]。鳃和消化腺是双壳类动物Cd2+暴露的重要靶器官[18]，在以往研究中，同时分析这2 种组织相关生物标志物也较为少见[19]，且不同试验条件对生物标志物有不同的影响，很难准确评估生物标志物的敏感性和指示性[16]。

本研究用亚慢性Cd2+暴露背角无齿蚌，检测鳃和消化腺中7 种生物标志物的变化，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（T-AOC）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA），旨在筛选出用于淡水环境Cd污染监测与评估的生物标志物，为背角无齿蚌作为“淡水贝类观察”的指示生物积累相关的研究资料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

背角无齿蚌购于山西太原五龙口水产品批发市场。购回后置于实验室内，用曝气48 h 的自来水清洗，去除蚌体表面附着物及泥沙等杂质，而后在实验室条件下（水温（14.65±0.31）℃，溶解氧（9.75±0.26）mg/L，pH 值8.34±0.12）饲养28 d。前14 d 不喂食，后14 d 投喂小球藻（每只每天喂食3.5×104个）。

1.2 主要试剂

氯化镉水合物（CdCl2·2.5H2O）（分析纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%过氧化氢（H2O2）（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司。SOD、CAT、GPx、GST、GSH、MDA 和T-AOC 测试盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 根据96 h Cd2+的LC50（134.9 mg/L）[15]设置Cd2+质量浓度为2.698 mg/L，进行Cd2+暴露，试验设4 个平行。选取大小相近的背角无齿蚌（20 只）置于聚丙烯塑料饲养箱（72 cm×52 cm×44 cm）内，染毒液体积为20 L。每2 d 换水一次，每天喂食一次。试验过程中未发现死亡个体。

1.3.2 样品制备 在Cd2+暴露0（CK），7，14，21，28 d，随机选取4 只蚌，解剖取鳃和消化腺，用滤纸吸净组织表面水分，迅速称质量后用液氮速冻，保存于低温冰箱（-80 ℃）备用。以预冷的PBS 缓冲液在冰上制备20%的组织匀浆液，2 800 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，用于各生物标志物的测定。

1.3.3 测定方法 SOD、CAT、GPx、GST、GSH、MDA和T-AOC 的测定均按照试剂盒说明书进行操作。试验中吸光度的测定均通过多功能酶标仪（SpectraMax M5，美国MD 公司）进行检测。

1.4 数据处理

以Excel 2010 和SPSS 20.0 软件对试验数据进行处理与分析，对各组间数据进行单因素方差分析并应用Tukey HSD 方法比较显著性差异（P＜0.05）。试验结果用“平均值±标准差”表示，以GraphPad Prism 6 进行柱状图的绘制。

2 结果与分析

2.1 镉对背角无齿蚌脂质过氧化产物MDA 的影响

背角无齿蚌经Cd2+暴露后，鳃MDA 含量随暴露时间的延长而逐渐升高，除在7 d 与对照组间无显著差异外，其余各组均显著高于对照组（P＜0.05）。消化腺MDA 含量虽有升高的趋势，但与对照组比较均无显著差异（图1）。

2.2 镉对背角无齿蚌抗氧化酶SOD、CAT、GPx和GST 活性的影响

背角无齿蚌经Cd2+暴露后，鳃SOD 活性与对照组相比均显著降低（P＜0.05），且随暴露时间的延长表现出先降低后升高的趋势，并在21 d 达到最低值，为对照组的71%。消化腺SOD 活性在Cd2+暴露14，28 d 显著高于对照组（P＜0.05），分别是对照组的1.3 倍和1.2 倍（图2）。

背角无齿蚌鳃和消化腺CAT 活性的变化如图3 所示。经Cd2+暴露后，鳃CAT 活性与对照组相比均显著降低（P＜0.05）。消化腺CAT 活性除7 d 外，均显著高于对照组（P＜0.05），且随着暴露时间的延长表现出先升高后降低的趋势，在21 d 达到最高值，是对照组的1.7 倍。

背角无齿蚌鳃GPx 活性在Cd2+暴露14 d 显著 低于对照组（P＜0.05）；消化腺GPx 活性除在14 d与对照组间无显著差异外，其余暴露时间均显著高于对照组（P＜0.05）。鳃和消化腺GPx 活性变化随Cd2+暴露时间的延长均表现出先降低后升高的趋势，都在14 d 达到最低值（图4）。

Cd2+暴露后，背角无齿蚌鳃GST 活性表现出先升高后降低的趋势，除在28 d 与对照组相比无显著差异外，其余暴露时间均显著高于对照组（P＜0.05）。消化腺GST 活性表现出先降低后升高的趋势，在7，28 d 均显著高于对照组（P＜0.05）（图5）。

2.3 镉对背角无齿蚌抗氧化剂GSH 含量的影响

Cd2+暴露后，背角无齿蚌鳃和消化腺GSH 含量高于对照组。鳃GSH 含量在14，21 d 显著高于对照组，且在21 d 达到最高值，是对照组的1.8 倍。消化腺GSH 含量除在28 d 与对照组间无显著差异外，其余暴露时间均显著高于对照组（P＜0.05），并在14 d 达到最高值，是对照组的1.7 倍（图6）。

2.4 镉对背角无齿蚌T-AOC 水平的影响

背角无齿蚌鳃T-AOC 水平随Cd2+暴露时间的延长而逐渐升高，并在28 d 达到最高值且显著高于对照组（P＜0.05）。消化腺T-AOC 水平则表现出先升高后降低的趋势，在21 d 达到最高值且显著高于对照组（P＜0.05）（图7）。

3 讨论

在正常条件下，机体内ROS 的生成和清除是动态平衡的[1，5]。当重金属等外界环境胁迫因素作用时，机体产生大量的ROS，过量ROS 的积累破坏了这种平衡状态[5]，导致蛋白氧化、脂质过氧化和DNA损伤[17]。MDA 是脂质过氧化的重要产物，可以反映生物体受ROS 攻击的程度[20]，是脂质过氧化和氧化应激的重要生物标志物[21]。许多研究发现，双壳类动物经Cd2+暴露后，机体内MDA 的含量升高[8，18，22]。但也有文献报道，经Cd2+暴露后，淡水双壳类Pyganodon grandis 消化腺[23]和太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）鳃[24]MDA 含量无显著变化。本研究中，背角无齿蚌经Cd2+暴露后，鳃MDA 含量在14，28 d 显著高于对照组，而消化腺MDA 含量却与对照组无显著差异。表明鳃受到的氧化损伤更大，或消化腺应对Cd2+暴露的抗氧化能力更强[8]。

生物体的抗氧化系统（包括抗氧化酶和非酶抗氧化剂）可以清除多余的ROS[7]，以保护生物体免受氧化损伤[5]。SOD 和CAT 是对抗氧化应激的第一道防线[1]。SOD 广泛存在于有机体中，可将超氧阴离子（O2-·）转化为过氧化氢（H2O2）[7]，随后被CAT 和（或）GPx 分解[5，8]。研究发现，SOD、CAT 和GPx 在抗氧化防御上具有一定的协同性[17，25]。本研究也发现，鳃和消化腺的SOD、CAT 和GPx 活性呈现一致性的结果，这3 种抗氧化酶活性在鳃中均表现出不同程度的抑制，而在消化腺中则表现出不同程度的诱导。有文献报道，背角无齿蚌经Cd2+暴露24～96 h，鳃SOD 和CAT 活性被诱导，GPx 活性无显著变化[15]；葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）经Cd2+暴露28 d，鳃SOD、CAT 和GPx 活性被抑制[26]。本研究中，背角无齿蚌鳃SOD、CAT 和GPx 活性均被抑制，表明经过较长时间的Cd2+暴露后，鳃可能聚集了大量的ROS，使得SOD 过度消耗[17]。也有可能是Cd2+改变了SOD 的空间构象，造成SOD 活性的降低[14]。除此之外，Cd2+也会对SOD 基因表达造成影响，从而使其酶活性降低[14]。而SOD 活性的降低也使其歧化反应产物H2O2减少，导致CAT 和GPx 没有被激活。Cd2+可结合GPx 前体，使GPx 的合成受到抑制[27]，也可结合GPx 的活性部位（Se-Cys），使GPx 失活[28]。据文献报道，葡萄牙牡蛎经Cd2+暴露28 d，消化腺SOD活性无显著变化、CAT 活性被抑制、GPx 活性被诱导[26]；背角无齿蚌经Cd2+暴露72 h，消化腺SOD 和CAT 活性被诱导[14]；文蛤（Meretrix meretrix）经Cd2+暴露5 d，消化腺SOD 和CAT 活性被诱导，GPx 活性被抑制[22]。本研究中，背角无齿蚌消化腺SOD、CAT 和GPx 活性被诱导，表明Cd2+暴露后，当大量的Cd2+被转运至消化腺并诱导其产生了大量O2-·，促使机体启动抗氧化系统，诱导SOD 活性升高，以保护机体免受损伤[14]。同时，机体内H2O2也由于SOD活性的升高而增多[29]，促使机体内CAT 和GPx 活性升高，从而清除过量的H2O2[30]。Cd2+暴露28 d，CAT活性稍有降低，但仍显著高于对照组，同时GPx 活性继续升高，这也充分说明二者共同清除H2O2，起到保护机体的作用[7]。

GST 是一种Ⅱ相解毒酶[17]，也是一种重要的抗氧化酶[19]，可催化Cd2+与GSH 的巯基（-SH）偶联，形成复合物GS-Cd 进行解毒[7]。GSH 是一种三肽，是维持水生生物氧化还原平衡的主要抗氧化剂[7]，可以直接清除ROS[8]，同时也是GST 和GPx 催化解毒反应的共同底物[17]。有研究报道，背角无齿蚌经Cd2+暴露96 h，鳃GST 活性表现为抑制—诱导，GSH 含量显著低于对照组[19]。本研究中，鳃GST 活性均表现为诱导，但GSH 含量显著高于对照组。随Cd2+暴露时间的延长，鳃SOD、CAT 和GPx 活性均表现为抑制—恢复，而GST 和GSH 则表现为诱导—恢复。同时，鳃GST 与GPx 活性在Cd2+暴露14～28 d呈明显的负相关。说明一方面在SOD、CAT 和GPx活性受到抑制时，GST 和GSH 代偿性的发挥了抗氧化作用[25]；另一方面，GST 与GPx 也在争夺共同的反应底物GSH[17]。鳃GSH 含量和GST 活性随暴露时间延长的变化趋势均是升高—降低，这可能说明鳃GSH 主要用作GST 反应底物，而不是用来清除ROS。另外有研究发现，背角无齿蚌经Cd2+暴露96 h，消化腺GST 活性被诱导[19]，菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）经Cd2+暴露48 h，消化腺GST活性被抑制[31]；背角无齿蚌经Cd2+暴露96 h[19]，文蛤经Cd2+暴露5 d，消化腺GSH 含量显著低于对照组[22]。本研究中，消化腺SOD、CAT、GPx 和GST活性均表现为诱导，GSH 含量也显著高于对照组，GST 与GPx 活性呈正相关。这表示消化腺中这些抗氧化酶（剂）被共同调动抵抗Cd2+暴露带来的氧化损伤。随Cd2+暴露时间的延长，消化腺GST 活性变化趋势为诱导—恢复—诱导，GSH 含量的变化趋势是升高—降低。这可能表明，消化腺GSH 除了给GST 和GPx 作为反应底物，同时也直接参与ROS清除。消化腺是双壳类动物的重要解毒器官，Cd2+可从体内其他器官转运至消化腺[32]，产生较多的ROS导致GSH 大量消耗[8]。

T-AOC 是反映机体内抗氧化酶和抗氧化剂共同的抗氧化能力，也是监测水体重金属污染的重要生物标志物[16]。背角无齿蚌经Cd2+暴露24～96 h，鳃T-AOC 表现为持续升高，消化腺先升后降[33]，这和本研究中T-AOC 的变化趋势一致。鳃T-AOC 的不断增强，表示其正积极对抗Cd2+暴露带来的氧化损伤。Cd2+暴露28 d，鳃SOD 等抗氧化酶活性和GSH 含量与对照组相比无显著升高，表明鳃可能也通过过氧化物酶（POD）、金属硫蛋白（MT）等其他抗氧化酶（剂）抵抗Cd2+作用。SOD 等抗氧化酶在Cd2+暴露28 d 仍保持较高的活性，这可能说明消化腺其他抗氧化酶（剂）受到明显的抑制。而消化腺T-AOC 在28 d 的降低，可能预示着随着Cd2+暴露时间的延长，消化腺氧化损伤的程度将加重。

背角无齿蚌经Cd2+暴露后，鳃和消化腺抗氧化指标的不同表现主要是由组织特异性所导致的[1]。双壳类软体动物具有多片鳃，与水直接接触，可以反映短期内镉污染状况[34]。而消化腺与哺乳动物的肝脏类似，具有解毒的重要生理功能，是中长期Cd2+暴露的靶器官[41]。同时，在应对Cd2+暴露，消化腺比鳃的能力更强[8，17]。本研究中关于MDA 的试验结果也证明消化腺受到的氧化损伤更小。

4 结论

本研究结果表明，背角无齿蚌经Cd2+暴露后，鳃和消化腺共同应对Cd2+暴露带来的氧化损伤。其中，鳃SOD、CAT 和GPx 活性受到抑制，GST 和GSH 代偿性的发挥抗氧化作用；消化腺SOD、CAT、GPx、GST 和GSH 均受到诱导。消化腺比鳃的抗氧化能力更强，受到的氧化损伤也更小。另外，对比各生物标志物与对照组的差异，鳃SOD 和CAT 的敏感性和指示性最强，消化腺CAT 在Cd2+暴露中后期、GSH 在Cd2+暴露中前期的指示性较好，可用作指示水体Cd2+污染的生物标志物。