基于1H-NMR 的不同基因型烟草的差异代谢物分析

魏克强，杨俊仙，李娟娟，宋 欣

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西大学经济与管理学院，山西太原030006；3.保定幼儿师范高等专科学校，河北涿州072750）

目前，我国烟草种质的遗传多样性水平较低、遗传基础相对狭窄，限制了烟叶品质的进一步提高。通过远缘杂交引进外源基因以改良品种、形成新物种和新类型已成为烟草育种的发展趋势[1]。烟叶燃烧后释放的烟气富含4 800 余种化学成分，有1/3 直接来源于烟草本身，其余的是通过燃烧、裂解、蒸馏、冷凝等一系列复杂的物理化学过程新产生的[2]，因此，烟草内源性物质的含量及性质直接影响了卷烟制品的安全性与可用性。

基因型是影响烟草化学成分的主要因素之一。代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学以相对分子质量1 000 以下的内源性小分子为研究对象，其种类和数量变化是生物系统对基因或环境变化的最终响应，日益成为遗传育种、环境毒理、疾病诊断、药物筛选等研究领域的热点[3-4]。基于核磁共振（NMR）和质谱（MS）的代谢组学新技术，国内外已对植物野生种与栽培种、野生型与转基因植株、品种间杂交后代的基因型差异进行了相关研究，表明这是一个有助于评价基因改造效果、筛选优良材料的方法[5-8]。魏克强等[9]利用分子标记和靶标分析技术揭示了导入白花曼陀罗（Datura metel L.）基因的烟草远缘杂交新品种曼陀罗烟与普通烟草（Nicotiana tobacum L.）的基因型差异，发现莨菪烷型生物碱（东莨菪碱、阿托品）是其差异性代谢产物之一，但尚未对化学成分进行整体、全面的分析。基于此，山西大学生命科学学院环境污染与健康风险实验室利用1H-NMR 技术结合主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）的多元统计方法，研究了曼陀罗烟及其亲本烟草78-04 的差异代谢物，旨在为指导烟草品质的遗传改良、构建烟气毒理的评价方法提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

供试烟草远缘杂交新品种曼陀罗烟及其亲本烤烟品种78-04，由山西农业大学烟草育种研究室提供。MS 固体培养基（北京索来宝），NMR 试剂重水（美国Norell）；氘代甲醇、氘代氯仿（德国Merck）等。Bruker 600-MHz Avance ⅢNMR Spectrometer（德国布鲁克公司），KDC-140HR 型高速冷冻离心机（安徽中科中佳），MGC-350HP 智能型人工气候箱（上海一恒）等。

1.2 试验方法

试验于2018 年3—8 月在山西大学进行。

1.2.1 烟草幼苗的培养 挑选颗粒饱满的种子，于培养皿中先用无菌水浸泡24 h，再用75%乙醇浸泡1 min，10%H2O2浸泡15 min，无菌水冲洗干净后接种于MS 培养基上，暗培养至种子破皮后，人工气候箱内进行光照培养（温度26 ℃，湿度75%）。

1.2.21H-NMR 的检测方法 参考文献[10]的方法，烟草幼苗培养60 d 后，取新鲜的叶片组织，液氮研磨。真空冷冻干燥后，称取200 mg，置于10 mL 的玻璃离心管中。加入蒸馏水和甲醇各1.5 mL、氯仿3 mL，室温下漩涡混匀1 min。将混匀后的样品置于超声清洗仪中，超声提取25 min；室温下，3 500 r/min 离心25 min。取上清液，减压浓缩蒸干，对上层甲醇水相浓缩蒸干物进行溶解处理：加入氘代甲醇400 μL与缓冲液400 μL 溶解，然后使用移液枪将圆底烧瓶中的溶液转移至离心管，4 ℃，13 000 r/min 离心10 min。取上清液600 μL 于5 mm 核磁管内进行600-MHz NMR 检测，参数为25 ℃，测定频率为600.13 MHz，扫描次数为64，谱宽为12 345.679 Hz。

1.3 数据分析

将核磁图导入MestReNova 软件，对核磁图进行定标（TSP：δ0.00），相位校准和基线校准后进行积分处理，以δ0.01 对积分区间进行分段积分，积分区段为δ0.76～9.34，切除其中甲醇峰δ3.29～3.32。将处理后的数据保存。使用SIMCA-P 13.0 软件对上述处理的积分数据作PCA 和OPLS-DA 分析，找出样品中的差异性代谢物。

2 结果与分析

对分离得到的提取物的核磁图谱进行代谢物指认，根据文献[7，11]提供的化合物化学位移、耦合常数以及核磁数据库，从烟叶甲醇水相的图谱中共指认出18 个代谢物，主要包括氨基酸类（亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、甘氨酸）、糖类（β-葡萄糖、α-葡萄糖、蔗糖）、有机酸类（延胡索酸、甲酸）、胆碱等物质。然后采用多元统计分析对数据进一步挖掘：在PCA 得分散点图的基础上建立OPLS-DA得分图，以消除组内及随机误差，使得数据的整体特征和变化规律更加明显，提高模型的有效性和解析力。筛选组间的差异性代谢物（图1）：由得到的OPLS-DA 得分图和S-PLOT 图，同时结合S-PLOT 图中VIP 值（＞1）寻找不同基因型烟草中的差异性代谢物，可见曼陀罗烟与78-04 能明显区分，其化学成分差异主要涉及γ-氨基丁酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、甘氨酸等代谢物，尤以氨基酸类最为明显。

3 讨论

在植物代谢组学研究中，核磁共振波谱技术（NMR）和色谱-质谱联用技术（GC/MS 或LC/MS）是目前最常用的技术平台，主要被应用于揭示植物对环境扰动代谢调控的生物标记物以及植物对遗传改变的代谢应答、鉴别不同基因型材料的差异。基于GC/MS 的分析显示，苹果酸和柠檬酸是辨别不同基因型拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Col0 和C24）最重要的代谢物，葡萄糖和果糖是辨别其杂交一代F1（C24×Col0 和Col0×C24）最重要的代谢物。基于1H-NMR 的代谢轮廓分析发现，色氨酸、甲酸、脯氨酸和苏氨酸的含量差异与2 个基因型（褐色籽与黄色籽）埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）的耐盐性差异密切相关，为生物乙醇材料的筛选提供了依据。基于1H-NMR 的代谢指纹分析，确定了区分野生型与表达水杨酸生物合成基因萨姆逊烟草植株的主要成分是绿原酸、苹果酸、葡萄糖和蔗糖；野生与栽培胡萝卜（Daucus carota L.）幼苗的绿原酸、阿魏酰奎尼酸含量存在差异，并表明其杂种后代具有母本遗传或野生品质优势[5-8]。但这2 种方法各具优点和局限性，要对所有代谢产物进行无偏向性的完整分析，1H-NMR 与GC/MS 相结合将是比较理想的手段[12]。

茄科烟草属（Nicotiana）植物的遗传背景相对狭窄，栽培烟草品种间的遗传相似性较高，迫切需要导入有价值的外源基因来拓展其基因池[13]。通常曼陀罗属（Datura L.）植物被用于提取莨菪烷型生物碱，具有很高的医药价值。烟草的化学成分极其复杂，小分子代谢物的结构种类繁多、理化性质差异巨大、含量极微且动态范围极宽、时空分布的差异明显、相互作用方式多样。燃烧后产生的烟气成分更是复杂多样，既有提供香气、吃味和生理作用的物质，也有产生杂气、刺激的物质，还有苯并芘、亚硝胺、烟碱等有害物质。笔者前期研究发现，基于国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）推荐的毒理学测试方法，即细菌诱变分析（Ames 试验）、细胞遗传学分析（微核试验）、哺乳动物细胞系细胞毒性分析（中性红试验）及大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，发现烟气暴露诱发的体外毒性效应、大鼠吸烟相关性的肺损伤和COPD 的疾病进程等方面的差异可能与不同基因型烟草的差异性化学组成有关[14-17]。与78-04 比较，曼陀罗烟的总糖、还原糖、总氮和蛋白质含量分别降低19.24%，22.04%，6.34%和9.25%[9]。本研究进一步发现了18 个小分子的差异性代谢物，尤以氨基酸类最为明显，但目前还不清楚它们对烟草品质、健康风险产生了哪些影响。传统的育种方法预见性差、工作量大，难以快速获得理想的类型，如何充分利用代谢组学信息来评价基因改造的效果、筛选出优良材料还有待于进一步研究。