屠宰养殖企业利用LAMP方法快速非洲猪瘟与实验室操作注意事项

杨军　刘金森　郝祯燕　王霞　王力强

非洲猪瘟病毒传染性强，死亡率几乎达到100%，目前还没有可用于预防和治疗的疫苗。1921年于非洲东部肯亚确认。1957年传出非洲，进入西班牙。在2007年开始进入俄罗斯境内，2017年3月，俄罗斯伊尔库茨克爆发非洲猪瘟疫情，该病由此从中东欧地区传播至俄罗斯东部，距离中国边界仅1000公里，威胁亚洲。2018年8月，我国发生了首例非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）的感染，这是我国首次发生非洲猪瘟疫情，截至2019年4月19日，全中国大陆31个省市自治区都传出猪瘟疫情。非洲猪瘟是一种高度接触性传染病，该病属于世界动物卫生组织的法定报告动物疫病。目前，尚无有效的非洲猪瘟疫苗和治疗方法。因此，在屠宰养殖企业快速准确鉴定非洲猪瘟成为迫切需求。本文将对屠宰养殖企业利用LAMP方法快速非洲猪瘟与实验室操作注意事进行阐述。

非洲猪瘟对我国的猪屠宰养殖企业的打击是非常沉重的，现在迫切的需要一套切实可行的防止办法，定期的在猪屠宰养殖企业的猪抽样检查是很有必要的，及时发现传染源，切断传播途径，可以避免财产损失，环介导等温扩增反应LAMP方法由于其简单快速准确特点，适用于我国的猪屠宰养殖企业鉴定筛查非洲猪瘟病毒。

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）由非洲猪瘟病毒引起的猪急性烈性传染病，由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染，其属非洲猪瘟病毒科，具有彩虹病毒的外观，痘病毒的内涵。该病毒是一种二十面体对称，带囊膜的双链DNA病毒，直径172～220nm，似六角形，基因组全长170kd，核苷酸序列已全部测定，含有151个开放性阅读框，5个多基因家族编码200多种蛋白，其中113种病毒蛋白的结构和功能已经清楚，32种为结合蛋白。病毒粒子含有至少28种结构蛋白，在感染细胞内有100种以上的病毒诱导蛋白，至少有50种能与感染猪或康复猪的血清反应。根据单抗分析结果表明，抗原变异主要发生于结构蛋白P150、P14、P12。标准的免疫学试验不能区分病毒株，但根据限制性内切酶分析能将病毒株区别，并分为不同基因型。

自然感染和人工感染此病毒均不产生型的中和抗体，究其原因，可能与免疫组织的损伤、病毒基因组的遗传变异、抗原竞争、免疫抑制、免疫逃避等有关。非洲猪瘟病毒对温度和酸的抵抗能力很强，室温干燥或冰冻数年仍存活，室温中经18个月仍能从血液和血清中分离出病毒。对高热敏感，在60℃经30min即死亡。对许多脂溶剂和常用消毒剂敏感。

日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反应（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP），其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA poLymerase）在等温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，基因的扩增和产物的检测可一步完成。

2019年1月4日中国动物疫病预防控制中心发布了《关于公布第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂评价结果的通知》，由国检验检疫科学院研发、北京森康生物技术开发有限公司生产的“非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒”成功入围，这也是本次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价中唯一入围的“核酸等温扩增类”检测试剂。

LAMP试剂盒诊断敏感性100%、诊断特异性100%、不需要特殊仪器、快速、结果判定简单，是屠宰养殖企业鉴定非洲猪瘟病毒的优选策略。

一、材料与方法

1、血液样本采集

实验人员事先消毒后，使用无菌的采血器对抽样选取的猪进行口腔静脉取血（图1）。血液低温4℃保存不超过24h，若需长期存放，需放置-80℃冰箱，尽量避免反复冻融（不超过3次）。

2、血液样本处理

取血液样本2ul，将10ul的PBS（PH7.2，含有1万单位青霉素和1万单位链霉素）均匀之混合，静置70℃，30min后灭活，3000r/min，4℃离心5min，取上清液，编号备用。

3、LAMP扩增步骤

①反应预混液配置（配置和分装在冰上进行）

每个样本配置16ul LAMP buffer，5.5ul引物液，0.5ulCMR染料，1.0ulBST酶，总反应液应比全部样本个数另外多加3例样本的体积。

②反应预混液分装

将配置的反应预混液涡旋均匀，瞬时离心后，按每管23ul分装与LAMP管内。

③加样

向对应LAMP管加入上述处理的血液样品20ul。同时，向阳性对照管内加入20ul阳性对照，向阴性对照管内20ul DEPC水。

④加入矿物油

向每管加入矿物油20ul，盖紧管盖，瞬时离心，转移至检测区。

⑤检测

将离心后的LAMP管放入检测仪内，设定好检测样品（S）、阳性对照（PC）、阴性对照的（NC）的位置，反应参数设置：采用64℃ 60min，每1min采集一次FAM通道荧光信号，共60个循环。

二、结果与分析

LAMP反应结果，由图2可见，左侧编号为4号为阳性对照，2号为阴性对照。有结果可以看出所有样品均没有感染非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）。

三、讨论

非洲猪瘟疫情迅猛，屠宰养殖企业为了有效避免财产损失，及时发现传染源，终止疫情传播，是迫切手段，也是必要手段。太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。本文针对屠宰养殖企业小型实验室操作注意事项做出如下总结：

1、实验室试剂严格按要求低温存放，避免污染;

2、采血器保证无菌，实验环境无菌，实验室定期紫外杀菌照射;

3、抽样的样本数量选取分群随机抽样办法，符合统计学原理，具有代表性;

4、实验结果记录，存档;

5、实验结束后，切记不要打开反应管，避免造成环境污染，按照实验试剂按照废液处理。

由于屠宰企业中猪数量庞大，在抽样时因注意选取数据量小的样本反映大的总体研究特性，误差范围在可以接受范围内。基于张志诚提出的基于地理学第一定律在疫病风险管理和控制中风险邻近概念，即在空间和时间上邻近的事件对与其相邻的空间单元和时间单元的风险影响要远大于较远的空间和时间单元的影响权重，建议采用分群随机抽样办法，例如对从外地引进的猪和本地猪分开成两个独立的群体，独立抽样，例外，成年与否、性别甚至是不同的品种也可以加权考虑在内，尽量做到满足代表性的原则。

此外，屠宰企业中对场地和设施的消毒也是避免感染的重要的一环，对猪舍定时清洁，及时定期的消毒，对粪便等污物作化学处理后采用深埋、堆积发酵或焚烧等方式处理。对办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒方式消毒。对消毒产生的污水应进行无害化处理。饲养管理人员可采取淋浴消毒。对衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒。

最后，LAMP鉴定非洲猪瘟方法已经在一些屠宰养殖企业加以利用，可以快速准确的鉴定非洲猪瘟，尽可能的保障人民和企业的财产安全。希望屠宰养殖企业能规范养殖和屠宰操作，防患非洲猪瘟与未然。

总之，非洲猪瘟对我国的猪屠宰养殖企业的打击是非常沉重的，定期的在猪屠宰养殖企业的猪抽样检查是很有必要的，及时发现传染源，切断传播途径，可以避免财产损失，经试验证明，环介导等温扩增反应LAMP方法由于其简单快速准确特点，适用于我国的猪屠宰养殖企业鉴定篩查非洲猪瘟病毒。

（作者单位：015000内蒙古巴彦淖尔市临河区动物卫生监督管理所）