四种常见离体脱位牙贮存介质对其牙周膜成纤维细胞生物活性的影响

许厚义　戴群　陈桥秀

【摘要】 目的：评价比较四种常见离体脱位牙贮存介质对牙周膜成纤维细胞活性的影响。方法：选取2017年1月-2018年1月本院口腔临床14～22岁青少年200例因正畸需要拔除的下颌第一前磨牙200颗作为研究对象，将其随机分为四组试验组（生理盐水组、牛奶组、唾液组、自来水组）和对照组，各40颗。培养脱位牙中的牙周膜成纤维细胞，其中试验分别采用生理盐水、牛奶、唾液、自来水作为贮存介质，对照组则直接在空气中保存。采用CCK-8法分别检测牙周膜细胞在四种常见离体脱位牙贮存介质中2、6、12、24 h不同时间点的活性，并与对照组进行比较。结果：各试验组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。生理盐水、牛奶及唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于自来水组，差异均有统计学意义（P<0.05）。牛奶、唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于生理盐水，且牛奶组12、24 h的牙周膜細胞存活率均明显高于唾液组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：牛奶、唾液贮存的牙周膜成纤维细胞活性较高，可作为有效的离体脱位牙临时贮存液，而生理盐水的保存效果次之，而自来水保存效果最差，不适合作为贮存介质。

【关键词】 牙周膜成纤维细胞; 脱位牙; 贮存介质; 生物学活性

【Abstract】 Objective：To evaluate the effect of four common in vitro dislocated teeth storage medium on the biological activity of periodontal ligament fibroblasts.Method：A total of 200 mandibular first premolars extracted from 200 cases of 14-22 year old adolescents in our hospital due to orthodontic treatment from January 2017 to January 2018 were selected as the research objects.They were randomly divided into four experimental groups（saline group，milk group，saliva group，tap water group）and control group，40 teeth in each group.The periodontal ligament fibroblasts were cultured in the dislocation teeth.The experimental group were treated with saline，milk，saliva and tap water as storage medium respectively，while the control group was stored directly in air.The periodontal ligament cells were detected by CCK-8 method in the storage medium of four common in vitro dislocation teeth for 2，6，12 and 24 h respectively.The activity at different time points were compared with the control group.Result：The survival rate of periodontal ligament cells in each experimental group at different time points were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The survival rate of periodontal ligament cells in the saline，milk and saliva groups at different time points were significantly higher than those in the tap water group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The survival rate of periodontal ligament cells in the milk and saliva groups at different time points were significantly higher than those in the saline group，and the survival rate of periodontal ligament cells in the milk group at 12 and 24 h was significantly higher than that in the saliva group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The periodontal ligament fibroblasts stored in milk and saliva have higher activity and can be used as effective temporary storage solution for dislocated teeth in vitro.The storage effect of saline is the second，while that of tap water is the worst，and it is not suitable for storage medium.

【Key words】 Periodontal ligament fibroblasts; Dislocated teeth; Storage medium; Biological activity

First-authors address：Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University，Key Laboratory of Stomatology and Biomedicine of Jiangxi Province，Nanchang 330006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.03.007

由于交通事故、突发事件等外力作用导致前牙外伤是口腔科常见的疾病。据数据统计，目前在世界范围内恒牙外伤的发生率已达10%～35%，其中牙脱位约占前牙外伤的0.5%～3.0%[1]。牙周膜细胞包括成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞等，它们具有牙周组织再生和修复的作用，其中牙周膜成纤维细胞是脱位牙再生存的关键。牙脱位再植后，周围可分裂的细胞将会吸收已破坏的牙周组织，受损较轻区域断裂的牙周膜纤维可进行功能性重建。因此尽量维持脱位牙牙周膜细胞的生物学活性对于保障脱位牙的再植成功率具有关键意义。但牙外伤意外发生时，外伤因素使牙齿完全脱离了牙槽窝，牙齿的牙周膜分为两部分，一部分紧贴在牙槽窝骨壁上，体内的良好环境和营养物质使其能够存活，而另一部分紧贴于脱位牙的牙根表面，体外干燥的环境中无法提供牙周膜细胞生长必需的营养物质。而脱位牙往往无法进行即刻再植，而脱位牙牙根表面牙周膜细胞如果长期处在干燥的环境中会因为缺乏细胞生长必需的营养物质而发生失活，需要将脱位牙及时、有效地浸泡保存在一个湿润、生理性平衡的介质中，以维持牙周膜細胞的生物学活性[2-3]。因此筛选常见易获取且有效的离体脱位牙贮存介质对于牙再植研究的成功具有重要意义[4-5]。目前生理盐水、牛奶、自来水、唾液、细胞培养基、椰奶及蜂蜜等是临床研究常用的各种脱位牙保存液[6-7]。由于生理盐水、牛奶、自来水、唾液这四种贮存介质在生活中最为常见，也容易获得，本次研究对这四种常见离体脱位牙贮存介质对牙周膜成纤维细胞活性的影响进行了比较，以为临床选择最恰当脱位牙保存处理方法提供参考依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集 选取2017年1月-2018年1月本院口腔临床上14～22岁青少年200例因正畸需要拔除的下颌第一前磨牙200颗作为研究对象，纳入标准：牙齿均发育正常;均无龋坏;X线片下牙周膜均无异常;口腔条件良好。排除标准：存在全身系统性疾病及近12周内有服用抗生素、免疫抑制剂。其中男109例（109颗），女91例（91颗），平均年龄（17.8±3.4）岁。将其随机分为四组试验组（生理盐水组、牛奶组、唾液组、自来水组）和对照组，各40颗。所有患者均知晓本次研究并签署知情同意书，该研究已经医院伦理学委员会批准通过。

1.2 仪器与材料 Heraeus GBB-16型CO2紫外清洁型培养箱、Olympus公司的IX51型倒置显微镜、Leica公司的RM2235型石蜡切片机、Eppendorf 5430R型离心机、美国Bio-Tek公司的酶联免疫检测仪、Costar公司的96孔培养板及培养瓶、日本同仁化学研究所的CCK-8试剂。生理盐水由上海长富提供（pH=7.0）、牛奶为上海光明牌的光明优（pH=6.7）、自来水（pH=7.5）和唾液（pH 6.6～7.1）。

1.3 方法

1.3.1 牙周膜成纤维细胞的培养 刮下脱位牙牙根中1/3部位的牙周膜组织，剪成小块，加入离心管中，采用全牙酶消化30 min，将经过消化的细胞过滤离心后弃去上清液，种植于25 mL培养瓶底，加入含10%胎牛血清（FCS）、链霉素[生产厂家：华北制药股份有限公司，国药准字：H13023985，规格：1 g（100万单位）]，用量为100 ?g/mL以及青霉素[生产厂家：重庆药友制药有限责任公司，国药准字：H50020765，规格：0.48 g（80万单位）]，用量为100 ?g/mL的DMEM培养液，在CO2孵箱中进行培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。6 h后翻转培养瓶继续培养。每2 d更换一次培养液。观察细胞生长达汇合点后即长满瓶低的70%～80%时，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化进行传代，传代比例1︰2，取第8代细胞用于实验。

1.3.2 牙周膜成纤维细胞活性的检测 选取生长良好的第8代人牙周膜细胞常规消化后，调整细胞浓度为8×103/mL，分别取100 ?L接种于4个96孔板内。在原培养液中培养24 h后弃去培养液，采用PBS溶液反复冲洗3遍吸干，然后分别加入不同的保存液150 ?L作为试验组：生理盐水、牛奶、唾液、自来水组，对照组则不加任何液体，直接在空气中保存。4个96孔板内分别在培养箱中放置2、6、12、24 h，培养条件：5% CO2，37 ℃。然后弃去保存液，采用PBS溶液反复冲洗3次，分别加入100 ?L的含有10% CCK-8检测试剂的DMEM培养基，继续培养2 h后，使用酶联免疫检测仪测定波长450 nm处的光吸收值（OD）。分析牙周膜细胞在生理盐水、牛奶、唾液、自来水四种离体脱位牙贮存介质中2、6、12、24 h不同时间点的存活率，并与对照组进行比较。为减少人为误差，各组在不同保存时间下的离体牙平均由两名实验人员按同一标准独立完成检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 生理盐水组中男23例（23颗），女17例（17颗）;平均年龄（17.6±3.3）岁。牛奶组中男22例（22颗），女18例（18颗）;平均年龄（17.7±3.5）岁。唾液组中男21例（21颗），女19例（19颗）;平均年龄（17.8±3.5）岁。自来水组中男22例（22颗），女18例（18颗）;平均年龄（17.9±3.6）岁。对照组中男21例（21颗），女19例（19颗）;平均年龄（17.9±3.7）岁。各组的性别、年龄一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 各组不同时间点牙周膜细胞存活情况比较 各试验组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。生理盐水、牛奶及唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于自来水组，差异均有统计学意义（P<0.05）。牛奶、唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于生理盐水组，且牛奶组12、24 h的牙周膜细胞存活率均明显高于唾液组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

脱位牙的牙周膜细胞在体外干燥的环境中会迅速失活并凋亡，而牙周膜细胞失活后的脱位牙在进行再植后，成功率将大大降低[8-9]。且研究发现随着脱位牙在干燥环境时间的延长，脱位牙再植后成功率也随之下降，因此需要将脱位牙尽快保存于生理性平衡介质中[10-11]。通过保存液的浸泡处理，既能提供牙周膜细胞生长所必需的营养，还能去除牙根表面的污染物及已死亡的牙周膜细胞，使部分牙周膜细胞恢复活性，从而保障再植术的成功率。

国内外学者针对牙离体脱位时的贮存溶液、环境温度、湿度，以及脱位贮存时间等进行了大量研究。实验数据表明，Hank平衡盐溶液，DMEM高糖培养基，含10% FCS的DMEM培養液等保存介质对于维持牙周膜细胞活性都有非常理想的效果[6，12]，但是这些材料在生活中并不常见，甚至很多普通人也许是闻所未闻，更无法在短时间内无法获得。因此目前临床公认的理想的保存介质应符合以下条件：（1）具有较为适宜的生理渗透性;（2）很少有细菌成分;（3）室温下能保存牙周膜细胞活性较长时间;（4）在事发现场或附近容易获得[13]。生理盐水、牛奶、自来水、唾液均是生活中常见且容易获得的贮存介质。牛奶具有较适宜的生理渗透性和pH值，其中很少有细菌成分，且含有细胞生长所需的维生素、氨基酸等营养物质，作为脱位牙的贮存剂能较好地维持牙周膜细胞活性避免其进一步凋亡[14]。有研究发现，与常温牛奶相比，低温（4 ℃）牛奶保离体牙的效果更佳，低温能减轻牙周膜细胞的消耗和肿胀，有利于保护牙周膜细胞[15]。唾液作为贮存介质，能保持牙周膜细胞原有的生态环境，从而发挥较好的贮存效果，牙体脱位后可直接将其含在口中浸泡于唾液中[16-17]。不过由于唾液中含有较多的细菌，不适宜进行脱位牙的长时间贮存。生理盐水的生理渗透性和pH值与牙周膜细胞相近，但是其中没有细胞生长所必须的营养物质，因此短时间内保持牙周膜细胞的活性，建议生理盐水的保存时间不宜超过2 h[18]。而自来水的pH值偏高，而渗透压远低于牙周膜细胞，容易导致牙周膜细胞迅速裂解而失活，因此保存脱位牙的牙周膜成纤维细胞时效果比较差，不建议作为首选保存液[4，19]。

本次研究对生活中常见的生理盐水、牛奶、自来水、唾液这四种贮存介质对脱位牙牙周膜细胞活性的影响进行比较发现，各试验组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。生理盐水、牛奶及唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于自来水组，差异均有统计学意义（P<0.05）。牛奶、唾液组不同时间点的牙周膜细胞存活率均明显高于生理盐水组，差异均有统计学意义（P<0.05）;且牛奶组12、24 h的牙周膜细胞存活率均明显高于唾液组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果提示牛奶和唾液可作为脱位牙的良好贮存剂，且牛奶长效贮存效果更好。而生理盐水可作为短效贮存剂，而自来水的贮存效果较差，不适合作为贮存介质。

综上所述，牛奶、唾液贮存的牙周膜成纤维细胞活性较高，可作为有效的离体脱位牙临时贮存液，而0.9%生理盐水的保存效果次之，而自来水保存效果最差，不适合作为贮存介质。

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（收稿日期：2018-06-19） （本文编辑：李莹莹）