甲醛缓释体类防腐剂对活体兔巩膜交联有效性的研究

许寅聪，仝春梅，赵亚芳，王超英

0引言

近年全球近视人口数量迅速增长，已引起社会的广泛关注，预测在2020年全世界有1/3的人口患有近视[1-2]。我国是高度近视高发国家，青少年高度近视患病率为6.69%～38.4%[3-5]。高度近视尤其是病理性近视因后巩膜持续扩展，眼轴持续增长，导致眼球后部血液循环障碍，逐渐影响视网膜和脉络膜，诱发高度近视视网膜病变[6]，如黄斑出血、黄斑裂孔、视网膜劈裂、视网膜脱离、后巩膜葡萄肿、漆裂纹样损害和Fuchs斑等，严重损害视功能[7-10]，但临床上尚缺少控制病理性近视的有效手段。研究发现，病理性近视患者巩膜生物力学降低[11-12]。受紫外线A-核黄素角膜交联技术在角膜疾病中应用的启发[13-14]，目前国内外学者积极探索通过巩膜交联方法增强巩膜生物力学(如应力、应变、弹性模量等)，以达到防治巩膜重塑，进而希望将其应用于病理性近视的治疗[15-17]。本研究旨在通过研究甲醛缓释体类防腐剂(FARs)对活体兔巩膜交联后的巩膜生物力学强度的改变来衡量其有效性，筛选出对巩膜胶原交联效果较强的FARs药物。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康无眼疾新西兰白兔170只(由河北医科大学实验动物中心提供)，1年龄，雌雄不限，体质量1.67±0.14kg，由本院实验动物中心饲养，室温20℃～23℃，白天自然光照射，光照与黑暗的周期比例为12h∶12h。入组前检查眼睑、角膜、瞳孔等未见眼部明显异常。本研究方案及实验动物的使用经本院动物实验伦理委员会批准(2018-KY-09)。

1.1.2主要试剂和仪器设备主要试剂：羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙内酰脲、恶唑烷、戊二醛均购自北京索莱宝生物科技有限公司。主要仪器设备：Instron 5544-C8024型主机及配套分析软件、2711-006型杠杆式纤维材料弹簧夹具均来自太原理工大学生物力学研究所。

1.2方法

1.2.1 实验动物分组及处理按照随机数字表法将实验动物分为17组，每组10只，其中15组为FARs药物组(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙内酰脲、恶唑烷)，每种药物根据给药浓度分为三个亚组即1/10最大允许浓度组、1/2最大允许浓度组、最大允许浓度组，另设戊二醛(阳性对照)组、空白对照组。所有动物均选择右眼为实验眼，左眼均未予以任何处理。FARs药物组动物结膜下注射FARs药物浓度见表1，注射部位分别为角膜缘后3mm Tenon囊下鼻上1∶00位、颞下7∶00位，各注射1次，每次0.25mL，每次注射间隔2d。戊二醛组动物结膜下注射50.00mmol/L的戊二醛，注射部位、剂量、频次等同FARs药物组。空白对照组动物结膜下注射生理盐水，注射部位、剂量、频次等同FARs药物组。

1.2.2 巩膜生物力学参数测量

图

1

各组动物巩膜极限应力情况。

1.2.2.1取材给药60d后，使用盐酸氯胺酮注射液(35mg/kg)麻醉动物后采用空气栓塞法处死，固定在手术台上，常规消毒后在无菌条件下取右眼，立即清除眼球表面结膜及筋膜组织，并将眼球按照分组进行标记，依次放入眼球保存液1(含25%新生牛血清、2%DMSO、2.5%蔗糖)、眼球保存液2(含25%新生牛血清、4%DMSO、5.5%蔗糖)、眼球保存液3(含25%新生牛血清、6%DMSO、7.5%的蔗糖)中，每种保存液中浸泡10min，最后放入眼球保存液4(含25%新生牛血清、7.5%DMSO、10%蔗糖)中，密封后放入-196℃液氮中保存。运输至力学实验室中将离体兔眼从液氮中取出后放入37℃水浴箱中复温，取鼻上1∶00位和颞下7∶00位角膜缘后巩膜，制作成5mm×10mm的巩膜条带。

表1 FARs给药浓度 mmol/L

1.2.2.2生物力学测试首先测量巩膜条带厚度，测厚仪由力学实验室提供，测量由同一人负责完成。之后将巩膜条带使用2711-006型杠杆式纤维材料弹簧夹具固定，微调夹具，使巩膜条带松紧适度，用游标卡尺测量夹具之间巩膜条带的长度并记录，使用Instron 5544-C8024型材料试验机依次执行蠕变实验、预拉伸实验、拉伸强度实验、拉伸破坏实验程序，计算弹性模量、蠕变率、极限应力和极限应变。

2结果

2.1巩膜厚度及生物力学参数给药60d后，各组动物巩膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)，而巩膜极限应力、极限应变、弹性模量、蠕变率差异均有统计学意义(P<0.001)，见表2。5种FARs药物对于极限应力、极限应变、弹性模量、蠕变率均有一定的增强效应，且具有一定的药物浓度依赖性。

2.2各组动物巩膜极限应力情况FARs药物组动物巩膜极限应力均较空白对照组增大，且除咪唑烷基脲和乙内酰脲1/10最大允许浓度组以外差异均有统计学意义(P<0.05)，但FARs药物组动物巩膜极限应力均低于戊二醛组，差异均有统计学意义(P<0.05)。分别给予5种FARs药物1/10最大允许浓度、1/2最大允许浓度、最大允许浓度，检测结果显示，羟甲基甘氨酸钠表现出最强的交联能力，巩膜极限应力增强最明显，分别为1.33±0.50、2.35±0.76、2.82±0.94MPa，分别为空白对照组动物巩膜极限应力的2.18、3.85、4.62倍；其次，交联能力较好的为重氮咪唑烷基脲组和恶唑烷组，最差的为咪唑烷基脲和乙内酰脲组，见图1。

表2 各组动物巩膜厚度及生物力学参数检测结果

组别巩膜厚度(mm)极限应力(MPa)极限应变(%)弹性模量(MPa)蠕变率(%)羟甲基甘氨酸钠组 1/10最大允许浓度0.30±0.041.33±0.50a,c30.19±7.91a,c7.70±1.94a,c8.26±3.19a,c 1/2最大允许浓度0.31±0.042.35±0.76a,c24.62±4.88a,c11.06±3.56a,c4.26±1.79a,c 最大允许浓度0.30±0.042.82±0.94a,c20.27±4.51a,c14.50±3.05a3.35±1.03a,c重氮咪唑烷基脲组 1/10最大允许浓度0.29±0.071.28±0.37a,c28.04±7.45a,c7.21±1.84a,c9.12±2.51a,c 1/2最大允许浓度0.29±0.061.80±1.07a,c23.81±4.93a,c9.61±2.65a,c6.38±2.21a,c 最大允许浓度0.31±0.052.65±0.67a,c18.27±6.03a12.76±2.53a,c4.25±1.94a,c咪唑烷基脲组 1/10最大允许浓度0.29±0.041.08±0.39c31.29±7.08a,c5.66±5.58c9.80±2.41a,c 1/2最大允许浓度0.30±0.081.45±0.38a,c27.949±5.55a,c9.18±1.53a,c7.01±2.03a,c 最大允许浓度0.32±0.071.84±0.30a,c22.27±4.44a,c12.12±2.90a,c5.84±1.22a,c乙内酰脲组 1/10最大允许浓度0.31±0.061.06±0.33c32.32±6.85a,c6.17±1.78c8.75±1.61a,c 1/2最大允许浓度0.29±0.061.59±0.68a,c27.55±7.18a,c9.24±2.05a,c6.33±2.70a,c 最大允许浓度0.28±0.051.89±0.46a,c21.69±5.66a,c12.51±2.89a,c4.80±1.52a,c恶唑烷组 1/10最大允许浓度0.32±0.031.23±0.35a,c29.83±5.55a,c7.15±1.31a,c7.69±2.68a,c 1/2最大允许浓度0.29±0.061.86±0.83a,c25.61±7.17a,c10.02±4.56a,c4.74±1.96a,c 最大允许浓度0.27±0.072.34±0.64a,c19.96±4.84a,c13.76±2.63a,c3.64±1.08a,c戊二醛组0.31±0.053.63±1.61a14.15±5.49a17.28±8.08a1.22±0.72a空白对照组0.30±0.030.61±0.2738.44±4.813.60±2.8411.82±1.58 F0.6310.418.9229.60816.494P0.86<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白对照组；cP<0.05vs戊二醛组。

2.3各组动物巩膜极限应变情况FARs药物组动物巩膜极限应变均较空白对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，但FARs药物组动物巩膜极限应变均高于戊二醛组，除重氮咪唑烷基脲最大允许浓度组以外差异均有统计学意义(P<0.05)。分别给予5种FARs药物1/10最大允许浓度、1/2最大允许浓度、最大允许浓度，检测结果显示，重氮咪唑烷基脲表现出最强的交联能力，巩膜极限应变分别为28.04%±7.45%、23.81%±4.93%、18.27%±6.03%，分别较空白对照组降低了27.05%、38.06%、52.47%；其次，交联能力较好的为羟甲基甘氨酸钠和恶唑烷，最差的为咪唑烷基脲和乙内酰脲，见图2。

2.4各组动物巩膜弹性模量情况FARs药物组动物巩膜弹性模量均较空白组增加，且除咪唑烷基脲和乙内酰脲1/10最大允许浓度组以外差异均有统计学意义(P<0.05)，但FARs药物组动物巩膜弹性模量均低于戊二醛组，且除羟甲基甘氨酸钠最大允许浓度组以外差异均有统计学意义(P<0.05)。分别给予5种FARs药物1/10最大允许浓度、1/2最大允许浓度、最大允许浓度，检测结果显示，羟甲基甘氨酸钠表现出最强的交联能力，巩膜弹性模量分别为7.70±1.94、11.06±3.56、14.50±3.05MPa，分别为空白对照组动物巩膜弹性模量的2.14、3.07、4.03倍，尤其是在最大允许浓度时几乎与戊二醛组接近；其次交联能力较好的为重氮咪唑烷基脲和恶唑烷，最差的为咪唑烷基脲和乙内酰脲，见图3。

2.5各组动物巩膜蠕变率情况FARs药物组动物巩膜蠕变率均较空白组显著降低，且高于戊二醛组，差异均有统计学意义(P<0.05)。检测结果显示，分别给予5种FARs药物1/10最大允许浓度，恶唑烷组动物巩膜蠕变率最低(7.69%±2.68%)，较空白对照组降低34.94%；分别给予5种FARs药物1/2最大允许浓度和最大允许浓度，羟甲基甘氨酸钠组动物巩膜蠕变率最低(4.26%±1.79%和3.35%±1.03%)，较空白对照组降低63.96%、71.66%；其次交联能力较好的为重氮咪唑烷基脲和乙内酰脲，最差的为咪唑烷基脲，见图4。

图2各组动物巩膜极限应变情况。

图3各组动物巩膜弹性模量情况。

图4各组动物巩膜蠕变率情况。

3讨论

病理性近视的发病机制与巩膜的生物力学特点和自身的缺点有关，因为从眼球壁三层结构的力学性能来看，在相同应力的作用下，从视网膜、脉络膜到巩膜的切线模量呈数量级递增[18]，在近视的发展过程中，肌成纤维细胞减少和收缩力下降，巩膜细胞外基质重塑，胶原减少，胶原分子内、分子间结构的不稳定和破坏，最终导致巩膜生物力学改变，并引起一系列高度近视病变影响视力。既往关于病理性近视的治疗方法较少，国内目前临床应用相对广泛的是后巩膜加固术，手术对于高度近视黄斑裂孔、阻止眼球继续增长具有一定效果[19]，但其加固材料尚存争议[20]，同时长期有效性、安全性仍需进一步观察。近年国内外学者积极探索将巩膜胶原交联引入病理性近视的治疗中，目前研究的巩膜胶原交联方法分为物理交联和化学交联两种，本研究是对巩膜化学交联药物的探索。

FARs具备较强的交联效应，同时具有缓释的特点，能有效延长药物作用时间，有可能降低药物使用剂量，这使得其具备巩膜交联治疗病理性近视的潜在优势。同时，FARs是一类被广泛应用于化妆品、个人护肤用品防腐(如皮肤修复产品、沐浴露、指甲油、洗发水、婴幼儿无泪香波等)的化合物，约有100余种，其应用已有数十年之久，考虑到其在日常生活中使用频率较高，且直接接触人体，却并未查询到其致癌变、致畸形的报道，故认为其潜在的安全性可能较高。欧洲化妆品和非食品科学委员会对FARs的安全性进行了广泛研究，欧盟理事会也在76/768/EC法令中详细规定了各种FARs在化妆品行业和纺织业中可应用的浓度。本研究选择的最大允许浓度则参考了欧盟理事会关于FARs的法令，但因FARs种类繁多，需进行实验筛选出交联效果强、毒性更低的种类。Babar等[21]通过测量经过FARs交联后巩膜的热变性温度和对人皮肤成纤维细胞的毒性反应认为，FARs是一类强效低毒性的交联剂。

我们通过查阅文献初步筛选出羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙内酰脲、恶唑烷五种较为有潜质的备选药物。既往研究认为，戊二醛是最强的化学交联剂，但其有较强的细胞毒性，所以一般用于工业和病理标本的固定，也常被用于交联技术研究的阳性对照药物[22]。此外，考虑本课题组既往已获得较成熟的建立幼兔形觉剥夺模型的经验，加上兔标本容易获得，体质量容易控制，故本研究对上述5种药物用于巩膜交联的有效性进行了活体兔实验研究，未选择其他动物。结果表明，羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、乙内酰脲、恶唑烷均表现出了明显的交联效应，增强了巩膜生物力学的强度，在极限应力、极限应变、弹性模量、蠕变率4个方面均增强，5种药物的增强效应均具有一定的药物浓度依赖性。其中，羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、恶唑烷三种药物交联效果更强。从生物力学参数检测结果来看，极限应力最多增大了363%(羟甲基甘氨酸钠最大允许浓度组)，极限应变最多降低了52.47%(重氮咪唑烷基脲最大允许浓度组)，弹性模量最多增加了303%(羟甲基甘氨酸钠最大允许浓度组)，蠕变率最多降低了71.66%(羟甲基甘氨酸钠最大允许浓度组)。但是考虑到未来临床使用的安全性方面，我们希望在低浓度时就能发挥出较高的交联效果，所以重点分析在1/10最大允许浓度下5种FARs的有效性，极限应力最多增大118%(羟甲基甘氨酸钠组)、极限应变最多降低27.05%(重氮咪唑烷基脲组)、弹性模量最多增大114%(羟甲基甘氨酸钠组)、蠕变率最多降低34.92%(恶唑烷组)。贾冠美[23]通过紫外线A-核黄素巩膜胶原交联实验发现，暴露兔巩膜后滴0.1% 5-磷酸核黄素 5min后，用波长为370nm，功率为3.0mW/cm2的紫外线灯进行照射20min后，弹性模量增加26.31%，蠕变率降低了40.47%，极限应力增加了12.21%。Liu等[24]对豚鼠进行了紫外线A-核黄素巩膜胶原交联实验，结果发现交联能显著增强巩膜生物力学强度。赵亚芳[25]对兔后Tenon囊下注射京尼平发现，实验眼和对照眼比较极限应力增加了39.27%，极限应变降低16.62%，蠕变率降低17.88%，弹性模量增加35.70%。Campbell等[26]和Levy等[27]研究证明后Tenon囊下注射京尼平能显著增强巩膜生物力学强度，同时电镜下观察其对视网膜结构未造成损伤，具有较好的安全性。Zyablitskaya等[28]研究认为后Tenon下注射40～400mmol/L(0.4mL)羟甲基甘氨酸钠均可以引起注射部位及其周围巩膜的交联效应，且具备明显的浓度效应，400mmol/L的交联强度是40mmol/L的6倍。上述研究结果表明，FARs具备显著的增强巩膜生物力学强度的能力。

本研究通过观察活体兔后Tenon囊下注射FARs后巩膜生物力学参数的变化表明，羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、恶唑烷具备较强的巩膜胶原交联效应，能够显著提高后巩膜生物力学强度，具备治疗病理性近视的潜能。但FARs药物也存在弊端，甲醛是一级致癌物，虽然目前尚无资料反应此类药物具备致癌效应，但应该进行充分的验来证明其安全性，本课题组也会在未来的研究中增加相应内容，如观察视网膜功能、视神经功能、巩膜组织及其周围肌肉血管神经的形态和功能改变，最终选出具备临床治疗病理性近视的可行性方法或药物，为临床病理性近视的治疗提供新的方法。