LC-MS/MS技术在兽药残留定性定量检测中的应用

李 芮

（四川大学化学工程学院，四川成都 615000）

随着色谱和质谱技术的日趋成熟，大量样品前处理新装置、新技术研发成功并很快商品化，使得兽药残留检测方法出现下面新特点：样品前处理，尤其是净化方式多样化；超高效液相色谱的出现使得分析速度大大提高；质谱的发展使得方法灵敏度逐步提高；多残留分析方法渐多；目前，绝大多数种类的兽药都可以采用LC-MS/MS法进行定性定量检测。

1 相关概念

动物源性食品：全部可食用的动物组织以及蛋和奶。包括动物肌肉、肝、肾、脂肪、奶、蛋、蜂蜜等。

兽药残留：可食用动物用药后，动物产品的任何食用部分中与所有药物有关的物质残留，包括原型药物或/和其代谢产物。

残留标示物：指在靶组织中残留时间最长的药物，可能是原型药物、代谢物、药物原形和代谢物。大多数药物的残留标示物是原型。例如，标示物为代谢物的有硝基呋喃类、喹噁啉类等，而标示物为原形和代谢物之和的有苯并咪唑类、恩诺沙星等。

最高残留限量（MRL）：对食品动物用药后产生的允许存在于食物表面或内部的该兽药残留的最高量/浓度（以鲜重计，表示为□g/kg）。MRL只对允许使用的药物而言。

兽药残留标示物决定了动物性食品残留检测的目标物，MRL决定了残留检测的结果是否合格，是否满足食品安全要求。

2 残留角度兽药分类

我国农业部235号公告（2002年）将兽药分为四类：第一类：食品动物允许使用，但不需要制定残留限量的药物，共80种（类），标准中规定了药物名称，动物种类，限用的给药途径、禁用动物等规定。第二类：已批准使用的兽药，在动物性食品中的最高残留限量标准，共94种（类）兽药的残留限量标准，标准中规定了药物名称、标志残留物、动物种类、靶组织以及残留限量。第三类：允许作治疗使用，但在动物性食品中不得检出的兽药，共9种。第四类：禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出的化合物，共19种（类）。

我国限用药物检测结果的判定为超过MRL即不合格。而禁用药物检测结果的判定，规定了判定限，对于禁用药物或允许作治疗使用，但不得在动物性食品中检出的药物，政府通常指定的样品中至少必须检出和能被确证的分析物的最小含量。例如β-受体激动剂的判定限为1或0.5μg/kg，氯霉素为0.3μg/kg，硝基呋喃代谢物为1μg/kg。

3 兽药残留的检测方法

（1）兽药残留检测的主要特点：待测物浓度低，残留量一般为μg/kg（ppb），甚至纳克/kg；样品基质复杂，动物组织多样，干扰物质多，如肝脏和肾脏；残留标示物形式多样，有原形和/或代谢产物，不同动物代谢产物也存在差异；前处理时间较长，一般都要经过提取净化等多个步骤；对从业人员有毒害，分析过程常用到甲醇、乙腈、氯仿等有毒有害化学试剂，需要相应的防护措施。

（2）兽药残留检测的主要过程：主要包括样品制备，分解和提取，分离和富集，最后是样品分析。在仪器分析之前，通常需要提取和纯化样品。大多数样品需要采用的预处理步骤由样品基质和分析物性质决定。目前，较常使用的样品处理技术是液液萃取（LLE）和液固萃取（LSE）组合使用。通过使用合适的有机溶剂进行脱蛋白/分析提取物和除去溶剂后（LLE），随后通过使用合适的固相萃取（SPE）程序纯化提取物。

（3）兽药残留检测方法制修订依据：我国农牧发[2003]1号文《兽药残留试验技术规范（试行）》规定了兽药在食品动物的主要代谢物或标志残留物的确定、MRL的确定方法、残留检测方法的建立、可食性组织和给药部位的残留浓度及消除规律试验方法、休药期的确定方法以及残留试验申报材料的具体要求。

（4）兽药残留检测标准方法制修订的技术参数：包括方法的灵敏度、检测限、定量限、线性、准确度和紧密度等。目前，灵敏度一般采用信噪比（S/N）法。检测限为3倍信噪比（S/N=3）相对应的空白组织添加浓度。定量限为10倍信噪比（S/N=10）相对应的空白组织添加浓度。线性包括标液标准曲线、基质匹配标准曲线等。标准曲线至少5个浓度水平，一般5～7个，线性范围要涵盖方法定量限和2倍MRL所对应的浓度水平。给出线性回归方程y=ax+b，相关系数（R²）至少要大于0.990。而准确度用回收率表示，回收率一般至少添加3个浓度水平，分别为定量限、1倍MRL和2倍MRL，也可另添加1/2倍MRL。精密度用变异系数表示，每批做5-7个重复（n=5-7），连做至少3d，计算每个浓度水平上n个样品的回收率、平均回收率和批内、批间变异系数（CV）。

（5）我国兽药残留检测方法概况：从检测方法原理上，可分为三类。理化分析法，主要有LC、LC-MS/MS、GC、GC/MS等。免疫分析法，主要包括ELISA法、荧光免疫测定法等。微生物法，主要有杯蝶法、活体动物拭子试验法等。

4 LC-MS/MS技术在定性定量检测中的应用

LC-MS/MS技术定性检测的法规要求，鉴别点（IPs）最低要求为规定残留限量的药物3个IPs，而禁用药则需4个IPs。LC-MS/MS的质量碎片类型有母离子和子离子两种，离子数为1个母离子，2个子离子，低分辨质谱的母离子的识别点为1.0，而子离子的识别点为1.5，因此可得低分辨质谱识别点数为4，而高分辨质谱的离子识别点为低分辨质谱的两倍。可见LC-MS/MS技术是符合法规要求的。

4.1 LC-MS/MS技术的工作原理

被测组分经过液相色谱（LC）分离后，进入质谱系统，在离子源将分析物由液态转换为气态带电离子，即准分子离子，经一级质量分析器（MS1）根据质核比（m/z）进行分离，得到的母离子进入碰撞室进行诱导解离，产生的特征碎片离子在二级质量分析器（MS2）进行分离。

LC-MS/MS技术的优点是通过选择检测MS1和MS2，可以给出准确的定性所需离子信息，有效降低本底噪音的干扰，在很大程度上提高检测灵敏度，且分析目标化合物的范围大，成为兽药残留检测的优选方法。而缺点是离子源存在基质效应，影响定量结果。

4.2 LC-MS/MS技术的基质效应

基质效应（ME）是指在样品测试过程中，由于待测物以外其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象。包括基质抑制效应和基质增强效应。

引起基质效应的原因主要有：待测物与样品基质成分在离子源离子化过程中竞争带电引起；样品中含有的内源性物质或体内药物的多个代谢产物或其他同类药物引起；前处理过程中塑料管内残留的聚合物、有机酸、缓冲液、SPE柱材料等引起。

而ME对方法准确度和精密度影响最大，消除基质效应有以下几种方法：

（1）选择合适的样品前处理方法：兼顾基质效应和回收率两方面因素选择前处理方法，一般来说LLE和SPE等充分进化过的样品ME较小。

（2）改善色谱分离条件：反向色谱分离时，最初流出的主要是基质中的极性成分，往往也是引起基质效应的主要原因，因此改善色谱分离条件，适当延长组分的保留时间，有利于减少基质响。

（3）优化质谱条件：基质效应主要对质谱的ESI源有影响，对APCI源影响不大。

（4）选用性质相似或同位素内标：采用内标法可以抵消ME。但当基质效应影响很大时，同位素内标也不能保证待测物和内标的比值恒定。

（5）采用较低的流速和较小的进样体积：可以使同时离子化的物质减少，从而减弱ME。

4.3 LC-MS/MS技术离子相对丰度要求

LC-MS/MS技术相对于单纯的LC技术，定性时除了保留时间的要求外，还要求离子相对丰度满足以下容许偏差要求：

相对丰度（%基峰） EI-GC-MS（相对） CI-GC-MS、GC-MSn、LCMS、LC-MSn（相对）＞50% ±10% ±20%＞20%到50% ±15% ±25%＞10%到20% ±20% ±30%≤10% ±50% ±50%

5 LC-MS/MS在定性定量检测中的应用

定性方法是指用于检测一种物质或一组物质在所关注水平上是否存在的方法。这些方法具有处理高通量样品的能力，用于大量样品定性可能的阳性结果。按照96/23/EC指令的要求，只有方法经过验证并在所关注的浓度水平上的假阴性率＜5%（β误差）的方法才可作为定性方法。如有可疑阳性结果，则要用确认方法进行确证。

使用LC-MS/MS法的MRM方式采集，对多种类药物（几十种上百种）进行非靶向检测，在回收率稳定且满足要求前提下，可直接作为定性方法和定量方法。定性方法要满足以下条件：空白实验不出现与阳性对照相同的离子峰；特征离子色谱峰信噪比（S/N）都在3：1以上；试样色谱峰保留时间应与校正溶液的一致，容许偏差为±5%；检测到的离子对丰度比与校正溶液的一致，容许偏差满足相关规定要求。而定量方法则可以MRM数据中响应强度最强的离子对作为定量离子对，采用基质匹配标准溶液外标法定量。