加味益气聪明汤对Aβ1-42诱导HBMEC细胞凋亡的保护作用及机制研究

黄江 杨云芳（通讯作者） 周姜 白雪 赵福兰

（西南医科大学附属中医医院 四川 泸州 646000）

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，发病机制复杂，患者生存率低，目前尚无有效的药物能够治愈该疾病[1]，给社会和家庭带来了极大的负担。Aβ的沉积导致脑血管内皮损伤可能是AD发病机制之一，可能与Aβ致血管内皮细胞细胞凋亡，产生炎症反应有关[2]。TLR4是机体参与炎症信号的重要受体之一[3]，特异性配体可以激活TLR4与COX-2信号通路，释放炎症因子IL-1、TNF-α[4]。

加味益气聪明汤主要含黄芪、人参、葛根、石菖蒲、远志等中药，现代研究表明其具有神经功能保护作用[5]，对阿尔茨海默病具有一定的改善作用。据此笔者通过体外培养HBMEC，研究加味益气聪明汤是否能减轻Aβ1-42诱导的HBMEC凋亡，探讨其保护效应与TLR4/COX-2表达的关系，为加味益气聪明汤临床用于AD治疗提供分子药理学依据。

1.材料

1.1 仪器

电泳转膜仪；超净工作台；酶标仪；激光扫描显微镜；流式细胞仪。

1.2 药品与试剂

加味益气聪明汤按要求提取纯化并制成每1ml相当于原药材1g的药液；CCK-8试剂盒；兔TLR4、COX-2多克隆抗体；Aβ1-42；TAK242；Hochest33342、FITC。

1.3 细胞

人脑微血管内皮细胞株（HBMEC）。

2.方法

2.1 细胞活力的测定

将各组细胞均加入50μmol·L-1Aβ1-42培养24h，同时加味益气聪明汤各浓度组加入相应浓度的药液作用30min，24h后加入CCK-8 10μL继续培养1h。酶标仪450nm波长处测定光密度（OD），以OD值的大小评价细胞活力。

2.2 细胞凋亡情况的检测及凋亡率的测定

同“2.1”项下分组、给药培养24h后，Hochest 33342/PI双染检测HBMEC凋亡情况，蓝色为正常细胞，亮蓝色为凋亡细胞，红色为死亡细胞；培养24h后收集细胞，冷PBS洗2次，悬浮于缓冲液中，取100μL细胞悬液加5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI，室温暗置15min，流式细胞仪测定凋亡率。

2.3 细胞中TLR4、COX-2蛋白表达的测定

同“2.1”项下分组给药培养24h，裂解10min，低温离心10min，取上清液备用。采用BCA法测定蛋白浓度。

2.4 统计学方法

3.结果

3.1 细胞活力

阴性对照组、对照组和加味益气聪明汤各浓度组细胞的OD值测定结果见表1，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组细胞活性及凋亡率检测结果 （）

表1 各组细胞活性及凋亡率检测结果 （）

注：对照组与阴性对照组比较，*P＜0.05；药物组与对照组比较，#P＜0.05。

组别 细胞活力OD值 细胞凋亡率（%）阴性对照组 0.99±0.12 0.97±0.11对照组 0.79±0.07* 19.69±0.08*加味益气聪明汤低浓度组 0.92±0.04# 10.32±0.06#加味益气聪明汤中浓度组 0.97±0.03# 5.02±0.02#加味益气聪明汤高浓度组 0.99±0.07# 2.11±0.04#

3.2 细胞凋亡情况及凋亡率

Hochest双染结果显示，阴性对照组细胞呈圆形，细胞核呈淡蓝色，几乎无凋亡细胞；对照组多数细胞细胞核呈亮蓝色，提示凋亡细胞较多，偶见红色细胞核的死亡细胞；加味益气聪明汤高浓度组凋亡细胞较少，加味益气聪明汤中、低浓度组可见少量凋亡细胞。

流式细胞仪测定结果显示，与阴性对照组比较，对照组细胞的凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，加味益气聪明汤各浓度组细胞的凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），各组细胞凋亡率检测结果见表1。

3.3 细胞中TLR4、COX-2 蛋白表达

与阴性对照组比较，对照组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组比较，加味益气聪明汤各浓度组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达均明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。各组细胞中TLR4、COX-2 蛋白表达测定结果见表2。

表2 各组细胞中TLR4、COX-2 蛋白表达的测定结果（）

表2 各组细胞中TLR4、COX-2 蛋白表达的测定结果（）

注：对照组与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；药物组与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 TLR4/β-actin值 COX-2/β-actin值阴性对照组 0.71±0.11 0.83±0.11对照组 0.94±0.06** 1.11±0.08**加味益气聪明汤低浓度组 0.88±0.03## 0.95±0.04##加味益气聪明汤中浓度组 0.81±0.04## 0.92±0.02##加味益气聪明汤高浓度组 0.72±0.04## 0.86±0.06#

4.讨论

Toll受体是机体重要的识别受体之一，目前发现的Toll样受体约有12种[6]。其中TLR4是识别特异性配体LPS，参与炎症信号的重要受体之一。TLR4激活后，会激活下游COX-2通路，释放炎症因子参与炎症反应[7]。有资料显示，AD的血管内皮细胞凋亡可能与TLR4的参与关系密切[8]，LPS启动的TLR4通路参与了AD的发生[9]。另有研究发现，TLR4缺乏的小鼠较TLR4野生型小鼠更容易发生淀粉样沉积和弥散。由此可知，TLR4可能与AD发生过程中内皮细胞损伤存在一定关联。

研究发现加味益气聪明汤对改善AD神经功能症状具体一定的疗效[10]，可能对Aβ1-42诱导的HBMEC细胞凋亡具有保护效应。本次实验结果显示，Aβ1-42刺激HBMEC后，细胞凋亡明显增加，细胞活力下降；与对照组比较，加味益气聪明汤作用后减少了Aβ1-42诱导的血管内皮细胞凋亡率，提高了细胞活力，因此加味益气聪明汤对Aβ1-42诱导的HBMEC凋亡具有一定的保护效应。进一步研究结果显示，加味益气聪明汤作用后减少了Aβ1-42诱导的HBMEC中TLR4、COX-2蛋白表达，推测其对AD的保护效应可能与抑制TLR4、COX-2 蛋白表达有关。

综上所述，加味益气聪明汤对Aβ1-42诱导的HBMEC细胞凋亡具有明显的保护效应，其保护效应可能与抑制TLR4启动的信号通路中COX-2蛋白表达有关，但其他的Toll受体是否也参与了加味益气聪明汤的保护作用值得进一步研究。