响应曲面法优选人参葛根煎膏醇沉工艺

丛 婧，王秀丽

（1.北京典奥中卫医药科技有限公司，北京 100054； 2.北京中医药大学，北京 102488）

保健食品不以疾病治疗为目的，可调节机体功能[1]，符合传统医学的“未病先防”理念[2]，近年来得到了规范化发展。人参葛根煎膏是拟开发的一款以人参、葛根等为原料的保健食品制剂。产品水提液中含有淀粉等成分，浓缩成清膏放冷后易成糊状，影响成品质量，需对提取液进行醇沉。为确保工艺的合理，需对醇沉工艺进行优选。本试验中以沉淀率和浓缩膏总皂苷含量为评价指标进行工艺优选[3-4]。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

D100B型数显定时恒流泵（上海青浦泸西仪器厂）；DHG-9055A型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器厂）；DTG系列超声波清洗机（鼎泰<湖北>生化科技设备有限公司）；SE402F型电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；MS204TS/00型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Q/IROE-07-201型微量移液器（1 000 μL，上海求精生化试剂仪器有限公司）。

1.2 试药

无水乙醇（分析纯，天津市北辰方正试剂厂，批号为20170503）；冰乙酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号为20170715）；Amberlite® XAD-2大孔树脂(Ballancom chemical Co.)；中性氧化铝（100 ～200 目，层析用 FCP，国药集团化学试剂有限公司，批号为20170110）；人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，含量93.4%）；香兰素（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20160326）；高氯酸（上海桃浦化工厂）。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

试样处理：取人参皂苷Re对照品0.010 1 g，精密称定，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得每1 mL含人参皂苷Re 0.969 6 mg的人参皂苷Re对照品溶液。取香草醛0.5 g，精密称定，加冰乙酸溶解并定容至10 mL，即得5%香草醛-冰乙酸溶液，使用前新制。

线性关系考察：精密吸取人参皂苷Re对照品溶液50，100，150，200，250μL，分别加入 5 支锥形瓶中，60℃热风挥干溶剂，用0.5 mL移液管各准确加入新鲜制备的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60℃恒温加热10 min，取出，流水冷却2 min，准确加入冰醋酸5 mL，充分摇匀，随行试剂空白，按紫外分光光度法，在560 nm波长处测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标、人参皂苷Re进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=3.534 4X-0.005 4，R2=0.999 3(n=5)。结果表明，人参皂苷Re进样量在58.17～407.20 μg范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 响应曲面优选试验

水提醇沉是中药制药重要除杂方法，醇沉的醇体积分数多选50% ～70%[5-6]，且为主要影响因素，醇沉时间多选1 d，因随时间的延长，变化趋于平稳，故本试验设计醇沉时间为20～28 h[7-9]。采用响应曲面优选设计（JMP软件），以醇沉浓度和时间为影响因素，确定水提醇沉工艺最佳区域。因素设计见表1，试验数据见表2。

表1 试验设计因素表

表2 试验数据表

取相对密度为1.10～1.15（60℃）的煎膏水提浓缩液。13份样品做醇沉试验，按表1安排响应曲面试验，各取80 mL样品，在一定量程的量筒中醇沉，达到规定的醇沉体积分数和时间后，记录醇沉后上清液体积(V1)，并吸取一定体积(V2)的上清液，减压浓缩（60～70℃，-0.06～0.08 MPa）去醇，放置表面皿中预冻，冷冻真空干燥12 h后称质量为m1，80 mL浓缩液的固形物总质量为m0，折算出沉淀量，按下列公式计算沉淀率。醇沉后将上清液收集浓缩至相对密度为1.20～1.30（60℃测），以此样品测定总皂苷含量。

2.3 数据分析

方差分析：结果见表3和表4。

表3 沉淀率方差分析结果

表4 总皂苷含量方差分析结果

模型适用性分析：模型拟合是否合适，需依据预测值与实际值的拟合情况判断。由图1可见，代表实测值的黑点均布于预测值两侧，P<0.05表示模型拟合合适。

工艺优选结果：由图2 C响应曲面等高线图的白色区域给出的为最佳操作区域可见，醇沉体积分数为58%～65%，醇沉时间为 22～28 h，总皂苷含量为3.75% ～4.05%，杂质去除率为76% ～78%。经计算，最佳操作点条件为醇沉体积分数60%，醇沉时间28 h，总皂苷含量最大值为4.08%，沉淀率最大值为77.58%。考虑到实际生产排班习惯，在以后的生产中拟取60%乙醇醇沉24 h为操作条件，预测总皂苷含量为3.80%，沉淀率为76.88%。

2.4 工艺验证

按优选工艺条件，重复操作3次，取平均值，并进行工艺验证。结果见表5。可见，工艺稳定性和重复性均良好。

3 讨论

中药水提液精制工艺中醇沉法较常用，可澄清提取液、减少服药量和去除杂质等，操作过程简单、溶剂安全性高、除杂效果好[10]。醇沉工艺选用适宜体积分数的乙醇，可有效沉降糊化淀粉、黏液质、蛋白质等杂质。多选用50% ～60%乙醇去除蛋白质、无机盐类杂质[11]。乙醇体积分数是醇沉的主要影响因素[7]，合理加以控制，系统地对醇沉工艺进行优选，可避免制剂中有效成分流失。醇沉体积分数对沉淀率和浸膏中总皂苷含量影响较大，随前者增加，后两者均先增大后减小，这与总皂苷的溶解度和杂质蛋白质与淀粉的溶解度有关，醇沉时间因素的影响则相对较小。

图1 预测值区间散点图

图2 响应曲面和优选等高线图

表5 工艺验证试验结果（%）

目前中药类保健食品中提取、醇沉工艺研究多选用单因素试验、正交设计试验对提取工艺进行优化筛选。其中，单因素试验次数多，并未考虑因素之间的交互作用，使得其成本较高；正交设计试验应用较普遍，可得出各因素间的交互作用及可能的影响趋势。响应曲面法[12]是优化随机过程的统计学方法，建立连续变量曲面模型，寻找试验指标与各因子间的定量规律，找出各因子水平的最佳组合。其在多元线性回归的基础上主动收集数据，以获得具有较好性质的回归方程。建立的多维空间曲面较接近实际情况，近年来研究应用实例较多，所需要的试验组数相对较少，优化工艺效果较优[13]，且不同于正交试验，只能在设定的条件中选择。

本研究中选取的产品是以人参、葛根等为主要原料制成煎膏，以水提醇沉工艺成型，为确保产品的质量，综合考虑产品标志性成分总皂苷含量、沉淀率等因素，利用JMP软件可视化能力强的特点，研究水提醇沉工艺最佳条件，结合模型拟合，确定以60%乙醇醇沉24 h，制得的煎膏符合最终产品质量标准。