米根霉复合诱变筛选高产L-乳酸的形态突变菌株及碳代谢流分析

孙小龙 付永前

摘要：以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL 395为出发菌株，通过紫外线与亚硝基胍（nitroso-guanidin，简称NTG）复合诱变，筛选出几株形态突变株，其L-乳酸产量较高，在此基础上，对得到的3株形态突变菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3和出发菌株NRRL 395进行代谢流分析。结果表明，在发酵初期，不同菌种的碳代谢流整体变化差别并不明显，尤其是流向有机酸合成的碳源所占的比例基本相同，此时细胞更多地合成生物量以及代谢所需的蛋白，对于球状菌体，其流向生物合成所需的碳相对较多;当发酵进入后期，碳流更多地用于有机酸的合成，而此时，不同菌体形态的碳代谢流明显发生变化，均匀球状菌体更有利于碳代谢流的流动，尤其是LA-UN-1球状菌体碳代谢流更易于流向L-乳酸合成途径，而原始菌株流向L-乳酸合成途径的碳流最小。

关键词：米根霉;L-乳酸;碳代谢流;形态突变菌株;诱变选育

中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0294-05

乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，用途极为广泛。乳酸作为一种古老而重要的有机酸，自1780年首次被发现至今，已被广泛应用于食品、医药、农业、化工等方面[1-3]。按其构型及旋光性可分为L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸等3类。L-乳酸是一种重要的天然有机酸[4]，世界上对L-乳酸的需求量在逐年上升，增长率高达15%，尤其近几年，人们利用L-乳酸聚合生成聚乳酸（polylactic acid，简称PLA），用以解决日益严重的环境污染问题，具有重大意义[5-6]。当前，L-乳酸生产方法分为发酵法、合成法和酶法，发酵法一般是以玉米、大米、甘薯等淀粉质为原料，经微生物综合利用代谢而成[7]。米根霉（Rhizopus oryzae）由于合成L-乳酸光学纯度高，而被越来越多地应用于L-乳酸的發酵生产中，但米根霉发酵由于其菌体形态不稳定而影响其应用。球状菌体作为米根霉合成L-乳酸的潜在形态而越来越引起人们的关注，针对菌球形态控制的研究也越来越广泛[8-9]。目前，大量文献报道，丝状真菌的菌体形态受遗传因素控制[10-12]。在此基础上，本试验尝试利用紫外线和亚硝基胍（nitroso-guanidin，简称NTG）复合诱变，筛选有利于L-乳酸高产的形态突变株，并深层次探讨L-乳酸高产形态突变菌株、出发菌株在不同阶段的代谢流变化，以期为米根霉形态的基因调控研究提供经验和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 米根霉（Rhizopus oryzae）出发菌株NRRL 395，由台州学院生物质资源研究所保藏。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，简称PDA）培养基：称取200 g去皮马铃薯，切块煮沸30 min，用双层纱布过滤，向滤液中添加20 g葡萄糖和20 g琼脂，补水至1 000 mL，于121 ℃灭菌30 min。种子培养基：30 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。发酵培养基：100 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条件与方法 将米根霉NRRL 395接种于PDA斜面培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养7 d，取培养好的斜面菌种，用无菌生理盐水洗脱孢子，接入三角瓶中，30 ℃、200 r/min振荡30 min，打碎孢子团块与孢子囊，使孢子充分散开，经无菌脱脂棉过滤，用血球计数板计数并调整孢子浓度为106个/mL;取1 mL孢子液接入装有50 mL种子培养基的 250 mL 三角瓶中，于30 ℃、200 r/min恒温摇床中培养24 h得到种子液;种子液接入5 L发酵罐（购自上海保兴生物设备工程有限公司）进行发酵。发酵条件：温度为30 ℃，搅拌转速为200 r/min，装液量为3 L，接种量为10%，通气量为 1.0 L/min，pH值用CaCO3控制在5.5～6.0范围内。

1.2.2 复合诱变选育 采用紫外线与NTG进行复合诱变选育，具体参考文献[13]。首先取0.5 mL孢子液，均匀涂布在直径为90 mm无菌培养皿上，用无菌风风干后，在30 W紫外灯下照射20 min，照射高度为20 cm;然后用0.5 mL生理盐水洗脱，洗脱的孢子悬浊液用浓度为100 g/mL的磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）在30 ℃条件下处理60 min。最后把反应液均匀涂布在配好的PDA培养基平板上，30 ℃培养2～4 d，生长出的米根霉菌体成熟后洗脱进行种子和发酵培养，进而筛选菌体形态和L-乳酸高产菌种。

1.3 代谢流网络模型建立

细胞大分子物质（糖、脂类、蛋白质） 涉及的代谢网络非常复杂，要建立一个完整的网络是比较困难的，因此作简化处理。根据相关文献[14-17]、米根霉的生化反应网络[18]以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，简称KEGG）等数据库资源，结合米根霉的生长代谢特性，建立米根霉利用葡萄糖发酵产乳酸的反应网络及其代谢流网络模型（图1），其中包括主要的碳骨架代谢途径。

构建代谢网络模型时作出以下简化和假设：（1）只考虑主要中心碳代谢反应的物流平衡;（2）对于中间代谢物的代谢库采用拟稳态假设，即瞬间浓度变化速率为0;（3）几个连续且无分支点的反应简化成1个反应式，所有反应方程包括生物量合成的过程均按固定比例进行;（4）能量供需平衡，即维持生物量与产物生成反应途径中消耗的能量与糖酵解途径（又称EMP途径，embden-meyerhof-parnas pathway，简称EMP途径）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA）产生的能量总数相等，辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，简称NADH）与还原型核素二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，简称FADH2）都可以通过电子传递链生产腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，简称ATP）;（5）菌体组分，如DNA、RNA、蛋白质等大分子的合成途径使用米曲霉反应模型[11]，在磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，简称PPP）的中间代谢产物中亦有流向大分子的流量，但由于与其他标出的途径相比流量甚微，因此忽略不计;（6）葡萄糖进入细胞时须消耗ATP;（7）TCA作为主要的能源提供途径，其中间代谢物的积累可以忽略不计。模型中包含的反应如表1所示。整个代谢网络含有53个反应，44个中间代谢物，此时自由度为9。该代谢网络中有6个可测速率，即葡萄糖消耗速率以及乳酸、富马酸、乙醇和生物量的生成速率，加上二氧化碳的含量变化速率。由于可测定的速率数量小于自由度，通过Matlab 7.5软件求解代谢分布。在此代谢网络中，葡萄糖作为碳源被细胞吸收，因此在代谢通量的计算中，将不同时间段初始葡萄糖利用的比值定义为100。

1.4 分析方法

发酵液的预处理：每隔一段时间对发酵液进行取样，于高速离心机上3 000 r/min离心10 min，分离得到上清液用于成分的检测;葡萄糖、L-乳酸、富马酸、苹果酸、乙醇、CO2的检测方法参考文献[13]。细胞干质量测定：对发酵液进行过滤，用蒸馏水洗涤2～3次，置于60 ℃恒温鼓风干燥箱至烘干至恒质量，用电子天平称质量。菌体电镜观察方法参考文献[19]。

2 结果与分析

2.1 复合诱变处理米根霉NRRL 395菌株

利用紫外线和NTG复合诱变处理出发菌株NRRL 395。诱变处理过后，经过初筛和复筛，筛选出高产L-乳酸的形态突变株，这些菌株与出发菌株NRRL 395相比，在相同的培养条件下易形成球状菌体，并且L-乳酸含量比出发菌株高，进一步对这几株菌株的菌体形态进行电镜观察发现，其球状菌体形态在微观环境下各异（图2），LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3等3株菌株的菌球形态较为规则，近乎圆形;LA-UN-4、LA-UN-5、LA-UN-6等3株菌株的形态偏向于椭圆形，而且形态越来越不规则;LA-UN-7、LA-UN-8等2株菌株的菌球形态较为松散，基本呈现放射状;另外，在菌球周边菌丝分布上，LA-UN-1菌株形成的菌球较为光滑，菌丝分散较少，其他菌株的菌球周边菌丝呈不同程度的放射状，尤以LA-UN-7、LA-UN-8最为明显。与此同时，对以上8株菌株与出发菌株进行乳酸发酵试验。观察发现，其乳酸产量差别较大，其中LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株的乳酸产量相对较高，最高均达到 40 g/L 以上，均高于原始菌株，而其他5株菌株，虽然也成球状菌体，但乳酸产量都偏低。对LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株在相同条件下培养得到的菌体进行乳酸发酵并进行观察发现，LA-UN-1菌株的产酸能力要明显高于LA-UN-2、LA-UN-3菌株（图3），且LA-UN-1传10代后，其乳酸产量以及菌球形态并未发生较大变化。

本试验利用紫外辐射和亚硝基胍复合诱变产乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形态突变菌株LA-UN-1，该菌株培养易形成直径在1.0～1.4 mm之间的球形菌体，在该菌株培养形态下，L-乳酸发酵产量最高达到59.5 g/L，比野生株产量提高54.5%。虽然，在之前的研究过程中发现，不同的培养条件如培养基、pH值等对菌体的形态都有影响，然而在筛选乳酸高产突变株的过程中，意外地发现通过紫外线和NTG诱变，同样可以得到形态突变菌株。从而，进一步验证了通过诱变选育手段，同样可得到形态诱变菌株。因此，可以进一步推测，生物个体发育与基因有序的选择性表达有关，许多变异的产生都是由于基因表达的变化所致，因此，通过比较同一类细胞给予不同刺激而产生的差异表达基因，可为揭示形态变化规律，探索菌体形态形成机制提供强有力的依据。

2.2 诱变菌株与出发菌株的代谢流分析

以选育所得到3株菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 和出发菌株NRRL 395进行发酵试验，并对发酵 24 h 后以及发酵结束后进行代谢流分析。由图4-A可知，在发酵初期，碳源的整体变化差别并不是很明显，尤其是流向有机酸合成的碳源所占的比例基本相同，而此时，碳源流向生物大分子物质的流量多一些，无论是氨基酸、核酸，还是碳水化合物或脂类均明显大于发酵后期，说明在发酵前期， 细胞更多地合成生物量以及代谢所需的蛋白， 且此时细胞中参与生物量积累反应须要消耗大量的能量和小分子物质，如氨基酸、核苷酸等。同时也发现，对于球状菌体，其流向生物合成所需的碳流量相对较多，也可能是菌球在聚集过程中，需要更多的物质来参与聚集反应。

从图4-B中可以看出，发酵后期流向生物大分子的碳流与发酵前期相比明显减少，而有机酸合成的碳流逐渐增加，由此可见，当发酵进入指数期后，碳流更多地用于有机酸的合成，而此时，不同菌体形态的碳流明显发生变化，流向乳酸的碳流在球状菌体下，尤其是LA-UN-1菌株培养的菌球最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小，与最大碳流相比，减少44%以上，而此时流向生物大分子的碳流相差不大。因此，笔者进一步分析认为，其原因可能是球状菌体在发酵前期，菌体合成了更多有利于乳酸合成的生物大分子或环境，其具体原因还有待于进一步研究。

3 结论

本试验利用紫外辐射和亚硝基胍复合诱变产乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形态突变菌株LA-UN-1，该菌株培养易形成直径在1.0～1.4 mm之间的球形菌体，在该菌株培养形态下，L-乳酸发酵产量最高达到59.5 g/L，比野生株产量提高了54.5%;在拟稳态的假设基础上，根据乳酸合成涉及到的生化过程以及菌体生长、产物的代谢过程，构建米根霉的乳酸代谢网络数学模型，并对诱变菌株和出发菌株进行代谢流对比分析;菌种在发酵初期，球状菌体流向生物合成所需的碳流量相对较多。当发酵进入指数期后，LA-UN-1流向乳酸的碳流最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小。不同的培养条件如培养基、pH值等对菌体的形态都有影响，因此针对下一步的研究，可以通过优化培养基改变菌体形态，以提高乳酸的产量，培养基的组分可以影响发酵产物的浓度、转化率、生产强度等。因此，可以采用单因子试验、Placket-Burman设计和中心组合设计试验对改组后的优良菌株進行培养基优化，以提高L-乳酸的产率和对糖的转化率并降低发酵成本，为该菌株的工业化生产打下基础。

参考文献：

[1]齐宏秀. 乳酸的应用及生产情况[J]. 辽宁化工，1996（1）：20-21.

[2]曹本昌，徐建林. L-乳酸研究综述[J]. 食品与发酵工业，1993（3）：56-61.

[3]王博彦，金其荣. 发酵有机酸生产与应用手册[M]. 北京：中国轻工业出版社，2000：30-36.

[4]Ruengruglikit C，Hang Y D. L（+）-Lactic acid production from corncobs by Rhizopus oryzae NRRL-395[J]. LWT - Food Science and Technology，2003，36（6）：573-575.

[5]李学梅，林建平，李绍壮. 固定化米根霉电渗析发酵生产L-乳酸的研究[J]. 食品科学，1996，17（9）：12-16.

[6]乔长晟，汤凤霞，苏建宇，等. L-乳酸高产菌株的诱变选育[J]. 食品工业科技，2002，23（2）：35-38.

[7]Eiteman M A，Ramalingam S. Microbial production of lactic acid[J]. Biotechnology Letters，2015，37（5）：955-972.

[8]Fu Y Q，Yin L F，Zhu H Y，et al. Effects of pellet characteristics on L-lactic acid fermentation by R. oryzae：pellet morphology，diameter，density，and interior structure[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，174（6）：2019-2030.

[9]Liao W，Liu Y，Frear C，et al. A new approach of pellet formation of a filamentous fungus -Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology，2007，98（18）：3415-3423.

[10]Meyer V，Arentshorst M，Flitter S J，et al. Reconstruction of signaling networks regulating fungal morphogenesis by transcriptomics[J]. Eukaryotic Cell，2009，8（11）：1677-1691.

[11]Riquelme M. Tip growth in filamentous fungi：a road trip to the apex[J]. Annual Review of Microbiology，2013，67（1）：587-609.

[12]Brody S，Tatum E L. Phosphoglucomutase mutants and morphological changes in Neurospora crassa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1967，58（3）：923-930.

[13]Bai D M，Zhao X M，Li X G，et al. Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of L（+）-lactic acid and metabolic flux analysis of mutants[J]. Biochemical Engineering Journal，2004，18（1）：41-48.

[14]Schmidt C G，Furlong E B. Effect of particle size and ammonium sulfate concentration on rice bran fermentation with the fungus Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology，2012，123：36-41.

[15]Xu Q，Li S，Fu Y，et al. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production[J]. Bioresource Technology，2010，101（15）：6262-6264.

[16]Maas R H W，Springer J，Eggink G，et al. Xylose metabolism in the fungus Rhizopus oryzae：effect of growth and respiration on L（+）-lactic acid production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2008，35（6）：569-578.

[17]Pitknen J P，Aristidou A，Salusjrvi L，et al. Metabolic flux analysis of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae using continuous culture[J]. Metabolic Engineering，2003，5（1）：16-31.

[18]Wright B E，Longacre A，Reimers J. Models of metabolism in Rhizopus oryzae[J]. Journal of Theoretical Biology，1996，182（3）：453-457.

[19]Fu Y Q，Li S，Zhu H Y，et al. Removal of cadmium（II） by mycelial pellet of Rhizopus oryzae from aqueous solution[J]. Asian Journal of Chemistry，2012，24（11）：5313-5318.孫莉娟，徐 阳， 鲁德金，等. 江苏省单季稻生育期内极端气候事件的分区变化[J]. 江苏农业科学，2019，47（1）：299-303.