德式乳酸杆菌对黄河鲤抗胁迫能力的影响

关素华 曾庆辉 张晓飞

摘要：为研究德式乳酸杆菌对黄河鲤应激前后抗应激指标、血液免疫指标、抗氧化指标和HSP70、HSP90基因表达的影响，选取黄河鲤450尾，随机分为5组（每组3个平行，每个平行30尾鱼），分别投喂在基础饲料中添加不同浓度乳酸菌（0、1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g）的日粮，养殖8周后，进行拥挤胁迫。试验结果表明：应激前，皮质醇浓度在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌组显著低于对照组（P<0.05），血糖和乳酸浓度在试验组显著低于对照组（P<0.05），溶菌酶活性在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05），C3和C4在1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05）。应激后，血液皮质醇、血糖和乳酸浓度都有不同程度的升高，这些指标在添加乳酸菌组的含量均显著低于对照组（P<0.05），血液溶菌酶活性、C3和C4浓度也有升高趋势，且在1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05）;应激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05），MDA含量呈相反的趋势，在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌组显著低于对照组（P<0.05），应激使HSP70和HSP90基因表达均有升高趋势，在应激前后试验组的HSP70和HSP90基因表达量大部分都显著高于对照组（P<0.05）。该研究结果显示，饲料中添加1×106～1×107 CFU/g 德式乳酸菌能提高黄河鲤的免疫力、抗氧化和抗应激的能力。

关键词：德式乳酸杆菌;黄河鲤;免疫;应激;抗氧化

中图分类号： S942.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0166-05

应激是一些有害因子引起动物发生一系列生理防御的总和。在水产养殖中，应激普遍存在，如溶氧量过低、水温变化、惊吓、高密度饲养、酸碱度变化、分池、捕捞等都可能造成应激。当鱼类受到这些应激后会出现一系列的生理变化，如体内皮质激素的升高，并引起溶菌酶、巨噬细胞和嗜中性粒细胞活力的下降，抑制动物的免疫系统，使其增质量减缓，成活率下降，严重影响水产养殖的经济效益[1]。因此如何防止和减轻应激发生是目前水产养殖研究的一个热点。

在过去，一旦疾病暴发，多使用抗生素来解决此类问题，但是使用抗生素带来了很多负面影响，比如病菌抗药性的增强、抗生素残留等问题。近年来，使用益生元和益生素来提高水产动物健康水平的报道也日益增多[2-5]，已有报道指出，果寡糖、芽孢杆菌、维生素、大黄素等在水产动物上均有抗应激的效果[6-11]，但是关于乳酸菌抗应激的功效报道较少，因此，本研究通过在饲料中添加不同浓度的乳酸菌，饲喂黄河鲤，研究乳酸菌对黄河鲤免疫、抗氧化和抗应激相关指标的影响，旨在探讨乳酸菌在黄河鲤上的作用效果，为防止鱼类疾病暴发和应激发生提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 黄河鲤鱼，购自河南省洛阳市某养殖场，初始质量为（15±0.3） g，试验选择规格一致、健康的鲤鱼450尾，随机分为5组，其中第1组为对照组，对照组投喂基础饲料，其他4组为试验组，投喂试验饲料，每组设3个平行，每个平行30尾鱼，共15缸。

1.1.2 试验饲料 基础饲料主要用鱼粉、豆粕、棉粕、菜粕作为蛋白源，以鱼油和豆油作为脂肪源，以次粉作为糖原，配制成蛋白含量为33.6%、脂肪含量为6.62%的基础饲料（表1），试验饲料是在基础饲料中分别添加1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g 德式乳酸杆菌，各种饲料原料充分粉碎后均过60目筛，先把磷酸二氢钙、食盐、预混料、膨润土等混匀，再加入大料并逐级混合，然后在乳酸菌中加入适量的水，与饲料原料混合后用绞肉机制成1.2 mm的颗粒饲料，并在40 ℃下烘 15 h，至饲料水分含量在10%左右，保存在-4 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 饲养管理 养殖试验于2015年7—9月在河南科技大学水族科学实验室进行，将黄河鲤驯化2周，驯养期间投喂基础饲料，试验开始后，每天投喂3次，分别在08：00、12：00、17：00各投喂1次，日投喂量为鱼体质量的3%～5%，并根据摄食情况进行适度的调整，确保饲料在0.5 h内吃完，养殖期间每天测水温、溶氧量，每2 d换水1次，每次换水1/3以保证水质，整个试验期间水质记录如下：水温为（26±1） ℃，溶解氧含量>5 mg/L，氨氮含量<0.01 mg/L，pH值为6.8～7.5，养殖周期持续8周。

1.2.2 抗应激试验 养殖试验结束后，停饲24 h，選取规格基本一致的10尾鱼，参照Xie等的方法[12]进行应激试验，采取高密度（100 g/L）进行拥挤胁迫试验，每个水平设3个平行，放置于小型玻璃缸中，水温、溶氧量同“1.2.1”节，应激期间保持安静，防止额外应激，持续应激6 h后进行采样。

1.2.3 血液采集与测定

1.2.3.1 血液指标的测定 分别在应激前和应激后对鱼进行麻醉，尾静脉取血，4 ℃、1 500 r/min离心10 min，取血清，于-20 ℃保存，用作应激和血液免疫指标的分析。皮质醇浓度采用放免法进行测定，血糖浓度的测定采用葡萄糖氧化酶法，乳酸浓度的测定采用对羟基联苯比色法，溶菌酶活性采用比浊法进行测定，补体C3和C4采用酶联免疫吸附法测定，以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体操作见说明书。

1.2.3.2 肝脏抗氧化指标的测定 应激前后快速分离肝脏，于液氮中速冻并保存，称取一定量的肝脏样品，用生理盐水按1 g ∶ 9 mL（肝脏 ∶ 生理盐水）的比例冰浴匀浆，然后于 4 ℃、3 500 r/min 离心10 min，取上清液用于酶活分析，超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照黄嘌呤氧化酶法，过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外法，丙二醛（MDA）含量的测定参照氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度计法。

1.2.3.3 基因表达 RNA提取：取肝脏组织0.1 g左右，参照Trizol使用说明书，提取RNA然后测定其浓度和质量，一般D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之间，最后稀释成相同的浓度进行cDNA反转录。

cDNA反转录：参照宝生物工程（大连）有限公司提供的试剂盒说明书进行反转录。反应程序：第1步42 ℃反应 40 min，第2步90 ℃反应2 min，最后于4 ℃保存。之后10倍稀释，以备RT-PCR使用。

RT-PCR过程：用Primer 5软件设计引物，由上海英捷维基生物有限公司合成（表2），按照SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa公司）使用说明进行RT反应，荧光定量PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55.9 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，45个循环;72 ℃延伸7 min。选用β-actin作为内参基因，用2-ΔΔCT方法计算HSP70和HSP90基因的相对表达量。

1.3 数据统计与分析

试验数据先用Excel 2007作简单处理，然后用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，当各组间差异显著时（P<0.05），用Duncans检验法进行均值间的多重比较，结果用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 德式乳酸菌对鲤鱼胁迫应激前后血清皮质醇、血糖和乳酸浓度的影响

由图1、图2、图3可知，应激前血液皮质醇、血糖和乳酸浓度都比较低，皮质醇含量在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌处理下显著低于对照组（P<0.05），其他各组之间差异并不显著（P>0.05）。血糖和乳酸浓度在试验组均显著低于对照组（P<0.05）。应激后，血液皮质醇、血糖和乳酸浓度都有不同程度的升高，这些指标在添加乳酸菌组中的浓度多数均显著低于对照组（P<0.05）。

2.2 德式乳酸杆菌对黄河鲤应激前后血液免疫指标的影响

由表3可知，应激前血液溶菌酶活性在1×106和1×107 CFU/g 乳酸菌组均显著高于对照组（P<0.05），1×

108 CFU/g 乳酸菌组和对照组差异并不显著（P>0.05）;C3和C4含量在1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05），其他各组之间差异不显著;应激后，血液溶菌酶活性、C3和C4浓度都有不同程度的升高，且1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05），C4含量在1×107 CFU/g乳酸菌组也显著高于对照组（P<0.05）。

2.3 德式乳酸杆菌对黄河鲤应激前后抗氧化指标的影响

由表4可知，应激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌组显著高于对照组（P<0.05），1×105、1×108 CFU/g 乳酸菌组和对照组差异并不显著（P>0.05）。MDA含量呈相反趋势，应激前后1×106、1×107 CFU/g乳酸菌组均显著低于对照组（P<0.05）。

2.4 德式乳酸杆菌对黄河鲤应激前后HSP70和HSP90基因表达的影响

由图4、图5可知，应激使HSP70和HSP90基因量表达均有升高趋势，在应激前后试验组的HSP70和HSP90基因表达量均显著高于对照组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 德式乳酸菌对黄河鲤应激指标的影响

皮质醇是鱼体受到应激后通过下丘脑垂体-肾间组织轴（hypothalamus-pituitary-interrenal axis，简称HPI）所分泌的一种重要的应激激素[13]。血液皮质醇升高通常作为鱼类发生应激的灵敏信号，本研究得出，在应激后皮质醇、血糖和乳酸含量都呈现显著升高的趋势，血糖的升高可能是由于随着皮质醇水平的升高，糖异生的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶的活性被激活，糖异生和糖原分解作用加强，另外，肌糖原的分解是血液乳酸含量增加的原因之一[14]。相似的研究结果在团头鲂（Megalobrama amblycephala Yih）[15-16]和金头鲷（Sparus aurata）[17]中都有报道。在饲料中添加适量浓度的乳酸菌，应激前后皮质醇、血糖和乳酸含量都有降低趋势，这表明乳酸菌可以有效地缓解黄河鲤的拥挤胁迫应激，但是具体的作用机制尚需进一步研究。

3.2 德式乳酸菌对黄河鲤血液免疫指标的影响

溶菌酶是机体内重要的免疫因子之一，主要由巨噬细胞核和嗜中性粒细胞分泌产生，本研究得出，在急性应激后，血液溶菌酶、补体C3和C4都有升高趋势，这可能是由于在急性应激条件下，鱼体通过增加特定溶菌酶和补体含量来增加其免疫活力，共同抵抗由应激带来的不适反应。有研究报道，一般急性应激会导致溶菌酶活性的升高[18-19]，而长时间的慢性应激会导致其活性的显著降低，免疫力下降[20]，发生应激后中华鳖（Pelodiscus sinensis）补体C3、C4含量下降[21]，但是添加维生素C能够促进补体C3和C4的合成，相似的结果在团头鲂[16]中也有报道。应激抑制还可促进补体C3和C4的合成，这与应激强度、应激时间以及应激类型都有很大的关系，但是适量的乳酸菌加强了溶菌酶的活性，也在一定程度上提高了补体C3和C4的水平，这有助于增强鱼体的非特异性免疫力。乳酸菌的免疫增强作用在畜禽的研究[22-24]中也有报道，据报道，乳酸菌胞外多糖具有免疫增强的作用[24]。

3.3 德式乳酸杆菌对黄河鲤抗氧化指标的影响

应激能够引起自由基的大量产生，比如 O-2 ·  和·OH，这些物质会造成机体细胞的脂质过氧化，正常情況下机体的抗氧化系统能够清除这些自由基，抑制机体过氧化，使机体处于平衡状态[25]，但是这种平衡状态会随着环境条件的改变而被破坏，造成氧化损伤。SOD和CAT作为主要的抗氧化酶，SOD负责把 O-2 ·  转化成O2和H2O2，CAT能够把H2O2分解成O2和H2O，以清除机体内过多的自由基[26-27]。本研究得出，SOD和CAT的活性在应激条件下不断增加，防止机体的氧化损伤。抗氧化物酶活性的升高和机体的氧化应激程度有关，氧化应激程度越高，酶活性也会随之升高[28]。之前的报道得出，SOD活性在应激条件下（比如盐度和温度）都有升高[29]。MDA含量在应激后呈现不断升高的趋势，这表明高密度应激会引起黄河鲤脂质过氧化程度的增加，这是因为应激会造成机体的耗氧量增加，容易造成自由基的产生，自由基与多不饱和脂肪酸等抗氧化脂类反应时，会引发脂质过氧化，并最终降解产生MDA。施兆鸿等研究表明，云纹石斑鱼（Epinephelus moara）在氨氮胁迫条件下的MDA含量也显著升高[10]，盐度胁迫使云纹石斑鱼的MDA含量显著升高，但是添加适量的维生素E可有效减少脂质过氧化物MDA的产生[11]。类似的研究结果在其他鱼类和水产类动物中[30-33]都有报道。本试验结果得出，在拥挤胁迫前后投喂1×106 CFU/g乳酸菌的SOD和CAT活性最高，MDA含量最低。本试验说明，乳酸菌能够抑制黄河鲤由应激引起的脂质过氧化程度。乳酸菌的抗氧化功能可能与它的益菌保护作用有关，以前的试验证明，乳酸菌的代谢产物具有抗氧化功能[34-36]，乳酸菌也可能作为调节肠道微生物平衡的物质促进机体的抗氧化功能。

3.4 德式乳酸杆菌对黄河鲤HSP70和HSP90基因表达的影响

在HSP家族中，HSP70和HSP90参与新生蛋白质合成和损伤蛋白的修复，并参与机体在应激条件下的免疫应答[37]，机体受到外界应激（比如高温、缺氧和细菌感染等）时，组织中HSP70和HSP90的表达量升高，从而形成保护机制，抵御应激对机体带来的危害[38-39]。本研究发现，应激后HSP70和HSP90的相对表达量都呈升高趋势，其表达量升高可能因为当鱼类处在应激条件下时，机体为了防止自身的氧化损伤而作出的相应策略。类似的研究在团头鲂的研究中[8]也有报道，Zhang等报道，在高温和氨氮应激条件下HSPs的表达量均呈升高趋势[6-7];刘波等研究表明，高温应激后比应激前罗氏沼虾HSP70 mRNA的相对表达量显著升高[9]，相似的研究结果在吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）[40]中也有报道。本研究得出，在饲料中添加一定浓度的乳酸菌应激前后HSP70和HSP90的表达均有升高趋势，从而增强了对机体的保护作用，HSPs在应激条件下的表达与细胞的分裂、增殖和发育等生理过程都有关系，需要进一步研究。本研究也得出，添加适量的乳酸菌能够增强HSPs的表达量和机体的抗应激能力，这和免疫指标以及抗氧化功能得出的结果相一致，表明乳酸菌在抗应激和增强免疫方面都起到重要作用。

4 结论

饲料中添加适宜水平的德式乳酸杆菌能够提高黄河鲤的抗应激能力、免疫力和抗氧化功能，且在本试验条件下，乳酸菌的最适添加量为1×106～1×107 CFU/g。

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