家兔产气荚膜梭菌的分离、鉴定及致病性分析

佘禄明

（松原职业技术学院，吉林松原 138001）

兔产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）感染引起的以腹泻和脱水死亡为特征的一种急性传染病（李天芝等，2019；史玉颖等，2018）。家兔是产气荚膜梭菌的易感动物之一，兔产气荚膜梭菌病可感染多个品种和年龄段，其中，对幼兔的危害最为严重，该病在幼兔中的发病率高达90%以上，死亡率为100%（马爱华和朱凤霞，2018；Tao等，2017；Zhao等，2017）。目前，该病已在山东、福建、重庆等20多个省市流行，该病的流行无明显季节性，但在冬春多发（李达伟，2018；陈锡存，2017）。这可能与气候、饲料等因素的改变有关，导致家兔产生应激反应，免疫力下降，肠道菌群失衡，促进产气荚膜梭菌的快速繁殖，肠道中的毒素累积，诱 发 疫 病（Waleed等，2016；Hamd等，2006）。患病家兔常出现精神不振、食欲减退、腹胀、拉胶冻样褐色稀粪等症状，最终脱水死亡（王晓丽等，2015）。

产气荚膜梭菌为该病病原，又称魏氏梭菌，是一种两端顿圆，单个或成对排列，可产生芽孢的革兰氏阳性菌，可产生多种毒素，对肠道危害最为严重，常形成坏死性肠炎和肠毒血症，在自然界中分布广泛（范国寿，2013；邢兰君和刘辉，2012；黄生莲等，2009）。产气荚膜梭菌种类多样，主要包括A、B、C、D和E型，其中A型最为常见且对动物危害最，严重，也是引起兔产气荚膜梭菌病的主要类型。产气荚膜梭菌的致病性主要与α、β、ε和τ、肠毒素和θ毒素等有关（吕长辉，2013）。目前，该病的防治方法主要为加强饲养管理与疫苗接种，但由于该病发病迅速，死亡周期短，家兔一旦发病，多数已无治疗价值（do Carmo等，2018；李伟东，2009）。因此，开展兔产气荚膜梭菌病的病原学研究十分必要，本研究针对家兔腹泻死亡病例进行产气荚膜梭菌的分离鉴定及致病性分析，为兔产气荚膜梭菌病的防控提供理论依据，也为产气荚膜梭菌疫苗候选株的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 10%兔鲜血平板由本实验室提供，TSC选择鉴别培养基购于北京陆桥有限公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker、细菌基因组提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，细菌通用引物F1/R1由生工生物工程有限公司合成，引物序列为：

F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R1：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.2 试验动物及分组 试验选取30日龄健康肉兔6只，随机分为试验组和对照组，每组3只。

1.3 病原菌的分离纯化 取肠道内容物划线接种于10%兔鲜血平板和TSC选择鉴别培养基中，置于41℃恒温培养箱中进行厌氧培养，并对纯化的病原菌进行革兰氏染色。

1.4 病原菌的分子鉴定 利用细菌基因组提取试剂盒提取纯化后的病原菌基因组，进行PCR鉴定，反应体系为：DNA模板2 μL，上下游引物 F1/R1各 0.2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，dd H2O 21.6 μL；反应条件：94℃预变性 3 min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸8 min，反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5 系统进化树的构建 将16S rDNA基因序列测序结果在NCBI中进行比对分析，并基于病原菌16S rDNA基因序列，借助MEGA5.0软件，利用N-J法构建系统的进化发育树。

1.6 生化鉴定 挑取病原菌单菌落接种于营养肉汤中，培养24 h，取适量菌液分别接种于生化鉴定管中，对病原菌的生化特性进行鉴定。

1.7 致病性分析 用PBS将菌液浓度调整为109cfu/mL，试验组肉兔通过腹腔注射稀释后的菌液0.2 mL/只，对照组腹腔注射相同用量的PBS，正常饲喂，观察记录肉兔发病情况，同时剖检死亡肉兔，并进行病原菌再分离。

图1 革兰氏染色结果

2 结果

2.1 革兰氏染色结果 通过对病原菌的分离纯化，分离到1株产气荚膜梭菌疑似菌株，革兰氏染色后发现，该菌为单个或成对排列的革兰氏阳性菌，结果见图1。

2.2 PCR鉴定结果 通过对病原菌16S rDNA基因序列的扩增发现，在1500 bp的位置出现单一条带，经测序确定其大小为1450 bp，与预期结果一致，结果见图2。

图2 PCR鉴定结果

2.3 系统发育进化树 将病原菌16S rDNA基因序列在NCBI中进行Blast比对分析发现，其与产气荚膜梭菌的同源性最高（99%）。在系统进化树中分离的病原菌与产气荚膜梭菌聚为一簇（NCBI登录号：Y12669.1），与梭菌属的破伤风梭菌和肉毒梭菌处于不同分支，而与芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌距离最远，结果见图3。

图3 基于16S rDNA构建的系统进化发育树

2.4 生化鉴定 通过对病原菌的生化鉴定发现，山梨醇、吲哚实验为阴性，其与检测项目均为阳性。

表1 病原菌生化鉴定结果

2.5 致病性分析 通过腹腔注射将分离纯化的病原菌攻毒肉兔，分析其致病性，发现实验组在攻毒8 h后开始出现精神萎靡、四肢无力等症状，12 h开始出现死亡，并伴随腹泻症状，16 h后试验组肉兔全部死亡，而对照组肉兔均正常。剖检死亡肉兔发现，肠道出现弥漫性出血点，肠道内有胀气，内容物呈水样，肠黏膜有脱落现象，症状见图4，对病原菌微生物进行再分离纯化，发现肠道内容物中有大量病原菌，经分子鉴定，确定与攻毒菌株为同一株菌。

图4 肠道病变

3 讨论分析

产气荚膜梭菌分布广泛，可存在土壤、饲料、饮水和粪便中，也可存在于人或动物的体内，人和动物一旦感染极易发病。兔产气荚膜梭菌病主要呈地区性流行或散发性发生，本病的流行无明显的季节性，但在冬春两季发病率较高。在饲养管理不当、饲料变更、气温变化、长途运输等多种因素影响下，兔抵抗力下降，各种条件致病菌易诱发疫病，导致肠道菌群失衡，若此时家兔肠道中存在产气荚膜梭菌，会在短时间内快速繁殖，分泌外毒素，引起家兔腹泻，严重者导致死亡。本病的主要临床症状为急性水样腹泻，发病初期粪便呈黑褐色，逐渐发展为黑褐色水样或胶冻状，后期发展为四肢瘫软，严重脱水，最终死亡。家兔感染后多在当日或次日发病死亡，少数周期较长，可达1周左右。吕长辉等（2013）利用划线接种法进行兔产气荚膜梭菌病例的病原菌分离时发现，肝脏病料中的产气荚膜梭菌分离率较低，而通过肉汤培养的方法可从多数病料中分到产气荚膜梭菌，提出产气荚膜梭菌大多不是单纯的肠毒血症致病致死，肠道中的产气荚膜梭菌可以突破肠黏膜屏障形成菌血症。虽然上述方法可以有效分离肝脏中的产气荚膜梭菌，但直接进行肉汤培养时会导致较多杂菌的繁殖，影响目标菌株的分离效果，因此，本研究以患病家兔肠道内容物为病料进行产气荚膜梭菌的分离纯化，成功分离到1株目标菌株。通过生化鉴定发现，病原菌的吲哚实验为阴性，与寇叙等（2014）等的研究相反，存在差异性。通过对分离到的产气荚膜梭菌致病性分析发现，家兔在攻毒8 h后出现精神萎靡、四肢无力等症状，16 h后全部死亡，而对照组肉兔均正常，表明所得菌株具有较强的毒性。杨军等（2014）虽然对兔源魏氏梭菌的毒性进行分析，但仅以小鼠为动物模型，未研究出病原菌对本体动物的致病性。本研究对家兔产气荚膜梭菌病进行了系统的病原分析与鉴定，明确了该兔场存在产气荚膜梭菌，具有兔产气荚膜梭菌病感染的风险，为兔场疫病防控指明了方向。

4 结论

对兔产气荚膜梭菌病疑似病例中病原菌的分离鉴定，成功获得1株兔源产气荚膜梭菌，具有较强的致病性，为产气荚膜梭菌致病机制的研究奠定了基础，同时也为疫病诊断和防控提供理论依据。