酸雨对Cd胁迫下大麦种子萌发及幼苗生长的影响

(1.晋中学院生物科学与技术学院， 山西 晋中 030619； 2.山西大学生命科学学院， 太原 030006)

植物生命历程的起点开始于种子萌发，萌发时的各种参数及生理特点直接影响植物后期生长发育状况，最终影响作物产量。自1960年开始，我国污灌的耕地逐渐扩大[1]，而重金属镉(Cadmium，Cd)经污灌排放到作物生态系统，最终在土壤中大量蓄积造成Cd污染[2-3]。大量研究表明，进入农田的Cd可以毒害植物，抑制其生长发育，影响代谢水平，严重时导致植物枯萎死亡，还可通过食物链影响人体健康[4-5]，在土壤被重金属污染的同时，另一个环境污染物酸雨(acid rain，AR)也在威胁着植物的生长。据报道，2015年我国酸雨污染的土壤约为72.9万km2，不同pH值的酸雨会影响植物的生长发育，在自然界，各种污染物经常以复合污染的形式出现[6-8]。

大麦(Hordeumvulgare)，营养丰富，蛋白质含量高，种植广泛，是开发保健食品的作物来源，也是制造啤酒的重要原材料[9]。大麦还容易培养、生长速度快、对环境胁迫因子较为敏感，是研究环境胁迫因子对作物影响的理想实验材料。目前，Cd与酸雨复合污染方面的研究主要集中在玉米[3]、紫萼玉簪[10]、大豆[11]和油菜[12]等几种植物上，而二者复合污染对大麦幼苗种子萌发及幼苗生长影响的研究还未见报道。鉴于此，本试验采用室内培养法，以大麦为试验材料，研究了外源Cd和模拟酸雨胁迫下大麦种子萌发和幼苗生长的响应，旨在揭示Cd和酸雨对大麦种子和幼苗生长的胁迫效应规律，探明大麦对Cd和酸雨胁迫的适应性反应特性，为污染地区大麦的栽培管理提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为大麦种子(晋科571)，购于山西省农科院品种资源所。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

酸雨配制参照周青等[13]的方法,设置pH值分别为4.0、5.0两个强度，记作pH 4、pH 5，并经PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)校准；Cd处理设置为5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-13个浓度(以纯Cd2+计)，记作Cd 5、Cd 10、Cd 20；Cd和酸雨复合处理组分别记作：Cd 5+pH 5、Cd 10+pH 5、Cd 20+pH 5、Cd 5+pH 4、Cd 10+pH 4、Cd 20+pH 4；以不加氯化镉且pH=7.0为对照(ck)。共设10个处理组，每处理组3个重复。

1.2.2材料培养

挑选籽粒饱满、坚实、大小基本一致的大麦种子，5% NaClO消毒30 min后，去离子水洗净，整齐放入铺有2层滤纸的培养皿中，在每一培养皿中放40粒大麦种子，将各处理组培养皿置于恒温培养箱中浸种萌发，条件控制为：白天25 ℃，黑夜20 ℃，自然光照，每天更换处理液1次，统计发芽数。

表1 酸雨对Cd胁迫下大麦种子萌发指标的影响

处理组/(mg·L-1)发芽率/%发芽势/%发芽指数活力指数异状发芽率/%ck97.50±3.1896.12±2.6529.27±1.525.06±0.360.00±0.00Cd598.33±2.54b97.46±1.92a*29.91±1.39a5.13±0.55a0.00±0.00aCd1096.67±2.16b94.28±2.54b*28.18±1.43b*4.89±0.48a0.00±0.00aCd2090.83±3.02b**85.27±3.09b**27.94±1.38a*4.59±0.61a*2.50±0.27a**Cd5+pH599.17±3.22a*97.65±2.81a*30.23±2.06a5.21±0.82a*0.00±0.00aCd10+pH597.50±2.17a95.26±1.69a*29.13±1.74a4.98±0.68a0.00±0.00aCd20+pH591.67±2.46a**92.11±2.86a**28.04±1.73a*4.66±0.81a*2.50±0.63a**Cd5+pH495.00±2.87c*94.91±3.28b*29.36±2.18b5.01±0.76b0.00±0.00aCd10+pH493.33±2.75c**90.51±2.67c**29.11±1.49ac4.76±0.45b*0.00±0.00aCd20+pH484.17±2.71c**81.24±2.65c**27.53±1.84a*4.56±0.59b**5.00±0.39b**

注：同列与ck相比，“*”表示差异显著(p<0.05)，“**”表示差异极显著(p<0.01)；同列相同Cd浓度不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

1.2.3测定方法

胁迫7 d时，按照周青等[13]的方法测定大麦种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、异状发芽率等种子发芽指标；幼苗的根长、苗长、生物量、根系耐性指数的测定参照肖志华等[14]的方法；α-淀粉酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定还原糖方法[15]；呼吸速率测定采用呼吸比重法[15]进行。每处理组的3个重复测量结果取平均值。

1.2.4统计方法

试验结果采用SPSS 21.0统计软件分析，差异显著性采用Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 酸雨对Cd胁迫下大麦种子萌发指标的影响

种子品质越好，发芽率越高，出苗数就越多。而发芽势、发芽指数和活力指数能够反映种子活力的强弱，活力强，出苗整齐一致，越容易增产[6]。由表1可知，在单一重金属Cd胁迫下，大麦种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的变化表现为：在处理浓度(0～20 mg·L-1)范围内，低浓度(≤5 mg·L-1)促进，5 mg·L-1时达最大值，4项指标分别比ck增加0.85%、1.39%、2.19%、1.38%；高浓度(≥10 mg·L-1)抑制，20 mg·L-1达最小值，4项指标分别比ck降低了7.63%、11.29%、4.54%、9.29%，且与ck差异达显著水平(p<0.05)，表现出低浓度Cd对大麦种子萌发有促进作用高浓度有抑制作用。随着酸雨的加入，在低浓度Cd与弱酸雨的复合处理组(Cd 5+pH 5)大麦种子前4项萌发指标都高于ck，且比相应的单一Cd处理组有所增加，说明弱酸雨的加入进一步促进了种子的萌发。其余2个处理组(Cd 10+pH 5、Cd 20+pH 5)4项萌发指标也都高于相应的单一Cd处理组，说明弱酸雨的加入对高浓度Cd处理下大麦种子萌发的伤害起到了一定的缓解作用。但随着酸性强度的增加，复合处理组(Cd+pH 4)4项萌发指标都低于对照，且都低于pH=5.0相同Cd浓度的处理组，二者表现出对大麦的协同伤害作用。

种子异状发芽表示只长出胚芽而胚根生长异常的种子，可反映逆境对种子萌发的伤害[13]。表1显示，大麦种子只有在高浓度(20 mg·L-1)Cd的单一胁迫和复合处理下才出现异状发芽，且酸性越强的处理组(Cd 20+pH 4)异状发芽率越高。综上说明弱酸(pH=5.0)对Cd胁迫下大麦种子萌发有一定的缓解作用，而酸性较强(pH=4.0)时则对Cd胁迫下大麦种子萌发表现为协同抑制作用。

2.2 酸雨对Cd胁迫下大麦幼苗生长的影响

表2表明，单一Cd胁迫对大麦幼苗的根长、苗长以及生物量产生了明显的抑制作用，3个指标随Cd处理浓度增加而逐渐下降，在最高浓度(20 mg·L-1)时，3个指标较ck分别下降了22.64%、21.68%、15.94%。在复合处理组中，随着酸雨的加入，大麦幼苗的根长、苗长以及生物量受到进一步的抑制，均低于相应的Cd单一处理组，且酸性越强和Cd处理浓度越大的复合处理组(Cd 20+pH 4)对3个指标抑制程度越大。表明重金属Cd和酸雨对大麦幼苗生长的伤害起到了协同抑制作用。

根系耐性指数是反映植物体耐逆境能力的一个指标[14]。从表2可以看出，在Cd处理浓度范围内，大麦幼苗根系耐性指数均低于ck，说明根系生长受到了重金属Cd的抑制。在复合处理组(Cd+pH 5和Cd+pH 4)，根系耐性指数随Cd处理浓度升高和酸性增强呈下降趋势，且都低于相应的Cd单一处理组，说明酸雨的加入，加重了对幼苗根系的伤害，阻碍了根系生长，使幼苗根系受到明显抑制。

表2 酸雨对Cd胁迫下大麦幼苗生长、α-淀粉酶活性和呼吸速率的影响

处理组/(mg·L-1)根长/cm苗长/cm生物量/mg根系耐性指数α-淀粉酶活性/[mg·(g·h)-1]呼吸速率/[mg·(g·h)-1]ck10.07±0.3212.41±0.75116.24±4.621.00±0.0026.73±1.36563.19±15.31Cd59.96±0.29a*11.96±0.69a115.43±4.37a0.99±0.04a28.45±1.25a**564.24±14.27aCd108.87±0.21a*11.64±0.62a*110.79±5.13a*0.88±0.02a*25.67±1.29a*518.92±17.44b**Cd207.79±0.18a**9.72±0.53a**97.71±3.52a**0.77±0.03a**23.19±1.09b**492.36±15.29b**Cd5+pH59.19±0.25b*11.36±0.79a*115.12±3.29a0.91±0.02b28.72±1.32a**564.44±16.17aCd10+pH58.41±0.17b**11.16±0.64a*108.26±3.64b*0.84±0.03b*25.91±1.34a*521.17±17.92a**Cd20+pH57.53±0.21b**9.35±0.49a**96.34±2.98a**0.75±0.02a**24.71±1.22a*495.12±16.68a**Cd5+pH49.02±0.31b*10.96±0.65a*112.29±3.45b*0.90±0.05b*26.68±1.26b549.71±18.21b**Cd10+pH48.17±0.26c**9.68±0.57b**107.68±3.07b*0.81±0.03c**25.28±1.31ab*466.82±14.64c**Cd20+pH46.29±0.14c**8.87±0.61b**92.76±2.85b**0.62±0.01b**21.06±1.19c**451.87±13.43c**

2.3 酸雨对Cd胁迫下大麦萌发种子α-淀粉酶活性的影响

从表2可见，大麦种子萌发时α-淀粉酶活性随Cd处理浓度增加表现为低浓度(5 mg·L-1)促进高浓度(10～20 mg·L-1)抑制，在5 mg·L-1时达峰值，相比ck增加了6.43%，且与ck差异显著(p<0.05),在20 mg·L-1时相比ck下降了13.24%，且与ck差异达极显著水平(p<0.01)。在复合处理组中，淀粉酶活性与ck相比随Cd处理浓度增加仍表现为先升后降的趋势，其中复合处理组(Cd+pH 5)始终高于对应的Cd单一处理组，随酸性强度加大在复合处理组(Cd+pH 4)中，α-淀粉酶活性随Cd处理浓度增加快速下降，表明高浓度Cd和高强度酸对酶活性有较强的抑制作用。

2.4 酸雨对Cd胁迫下大麦萌发种子呼吸速率的影响

呼吸速率可作为反映种子萌发过程中能量代谢状态的一个指标[13]。表2数据显示，不同浓度Cd(5～20 mg·L-1)胁迫下，大麦萌发种子呼吸速率随Cd浓度升高呈先升后降趋势，与α-淀粉酶活性表现一致。在复合处理组(Cd+pH 5)中，(Cd 5+pH 5)组呼吸速率略高于ck，其余组合均低于ck，且随Cd处理浓度增加而减小。随着酸性增强，复合处理组(Cd+pH 4)显著抑制呼吸速率，随Cd处理浓度增加快速下降，且都低于对应的Cd单一处理组，分别比ck降低了2.39%、17.11%、19.77%。说明弱酸对低浓度Cd处理种子呼吸速率的伤害有一定的缓解作用，而酸性加强时则表现为协同抑制作用。

3 讨论与结论

作为植物生命周期起始点的种子萌发，能够最早感受到逆境胁迫，种子萌发状况直接影响作物后期发育[14]。已有研究表明，无毒的重金属Cd变为游离态Cd2+，与其他物质化合后再被植物吸收，就会发挥出极大的毒性，并可富集于植物体内，带来持续伤害。本试验表明，在所处理的Cd浓度范围内，大麦种子发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数4个萌发指标随Cd浓度增加呈先升后降趋势，镉离子浓度越大，抑制效应越强，此结果与曾翔等[5]和欧丽等[16]所得结果一致。低浓度Cd表现对植物种子萌发的正面促进作用，原因可能是低浓度Cd促进了植物细胞分裂，对其生长有一定的刺激作用[17]，而高浓度Cd明显抑制大麦种子萌发，对种子产生毒害作用，与罗良旭等[10]和崔大练等[18]的研究结果一致。当Cd与酸雨复合在一起时，本试验发现，低浓度Cd与弱酸雨处理组(Cd 5+pH 5)对大麦种子萌发表现为协同促进作用，并且弱酸对高Cd浓度下种子萌发的伤害起到了一定的缓解作用，原因可能是酸雨加剧了对种皮的破坏而有利于其萌发。而随酸雨强度加大，二者主要表现为协同抑制作用，加剧了对种子的毒害，使异状发芽率升高(表1)，这与吴鹏等[19]的研究结果相同。

过量重金属胁迫会抑制植物生长[14]。从本实验结果可以看出，单一Cd胁迫下随浓度增加，大麦幼苗的根长、苗长、生物量均受到抑制而下降。这与周青等[20]和韩超等[21]的研究结果相同。已有研究表明，植物体内积累过多的非必需Cd元素，会与Ca2+竞争活性位点，导致被激活的CAM和Ca2+-ATP酶减少，并且会加速幼苗根系产生大量活性氧，抑制各种酶活性，细胞有丝分裂速度变慢，使根系生长受阻，吸收和利用的矿质元素减少，最终生物量降低[14]。当Cd与酸雨复合在一起时，本试验发现，在所处理的重金属Cd浓度范围内(5～20 mg·L-1)与酸雨复合处理对大麦幼苗生长的影响表现为协同抑制作用，并且酸性越强和Cd浓度越高对幼苗的伤害越大。这与李萌[3]的研究结果不相同，原因可能是试验材料对酸雨的抗逆性不同。

种子萌发初期，α-淀粉酶水解种子内贮藏的淀粉为葡萄糖，用于幼苗的形态建成和生长发育的物质和能量来源，其活性强弱与种子萌发有着密切关系[22]。本研究表明，在5 mg·L-1的Cd浓度下大麦萌发种子α-淀粉酶活性与ck相比有增加，而后随Cd浓度升高活性降低，表现为“低促高抑”，低浓度重金属对植物积极的“刺激作用”[17],类似的结果在其它植物研究中也得到证实[23]。酸雨的加入，使不同浓度Cd与弱酸雨处理组(Cd+pH 5)的α-淀粉酶活性高于相应的Cd单一处理组，尤其是低浓度组(Cd 5+pH 5)更为活跃，表现低浓度时二者对α-淀粉酶活性的协同促进，而后随酸雨强度增加快速下降，表现对α-淀粉酶活性的协同抑制。这与艾斯卡尔等的试验结果类似[24]。相关资料表明，α-淀粉酶是Ca2+依赖性酶，在高强度酸雨和高浓度Cd2+胁迫下,大量H+或Cd2+进入胚细胞，影响酶分子氨基酸侧链或占据Ca2+与淀粉酶的结合位点，导致酶的构象改变，酶活性降低[22]。

呼吸速率反映种子萌发过程中能量代谢状态[6]。郝怀庆等研究发现，低浓度的Hg2+能提高水鳖叶片呼吸速率，浓度升高则降低呼吸速率[25]。本研究结果与此类似，Cd胁迫后大麦萌发种子呼吸速率随浓度增加先升后降，表现为低浓度时积极的刺激作用，这种促进随着弱酸雨的加入在复合处理组(Cd 5+pH 5)更加明显，而后随Cd浓度增加和酸雨强度加大呼吸速率开始下降，产生较强的抑制作用。原因可能是低浓度下的Cd2+或弱酸雨促进植物体内的过氧化氢酶、过氧化物酶和酸性磷酸酶等的活性，促进三羧酸循环，产生能量，形成修复性增强呼吸作用，加强机体代谢，以抵御逆境造成的伤害，从而使呼吸代谢等在逆境条件下有异常升高的现象，但随着Cd2+在细胞内的积累，特别是在膜系统上附着的增加，线粒体结构和功能遭受损伤和破坏，呼吸强度降低[26]，或者是因为低浓度下的Cd2+或弱酸雨使α-淀粉酶活性增高，产生较多可溶性糖，使呼吸作用所需底物增多从而加强呼吸速率。还可能是因为高浓度下的Cd2+或H+损伤了细胞膜上的ATPase，扰乱了膜两侧的pH梯度，从而影响细胞呼吸代谢过程[27]。

综上所述，酸雨对Cd胁迫下大麦种子萌发和幼苗生长影响有所不同。各项种子萌发指标表现为低Cd浓度(≤5 mg·L-1)和弱酸(pH=5.0)时的协同促进作用与高Cd浓度(≥10 mg·L-1)和强酸(pH=4.0)时的抑制作用，而大麦幼苗的生长则受到二者的协同抑制，酸雨的加入增加了对幼苗生长的伤害。