婴幼儿配方奶粉中甘油三酯Sn-2位脂肪酸的检测

2019-08-12王俊芳杨国良王荣艳

中国乳业 2019年7期

文/王俊芳杨国良王荣艳

（1 杭州千岛湖天鑫有限公司滨江分公司；2 杭州璞湃科技有限公司；3 杭州立高检验检测技术研究院有限公司）

脂肪是婴幼儿配方奶粉的重要组成部分，不仅提供婴幼儿生长发育所需能量50%～60%，还促进多种维生素和矿物质的吸收，其中甘油三酯占总脂肪的比重最高。

根据研究表明，脂肪酸在甘油三酯上的空间分布对脂肪和钙的吸收具有较大的影响[1]。Jensen等[2]研究表明婴儿对Sn-2位棕榈酸含量较大的奶粉中肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的吸收率较高。Lopez等[3]研究还发现婴儿食用高含量Sn-2位棕榈酸婴儿配方奶粉较食用普通婴儿配方奶粉的粪便中的棕榈酸含量低，更证明了其对肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的吸收有增强效果。Carnielli等[4～5]采用Sn-2位棕榈酸含量不同的配方奶粉喂养婴儿，结果表现为用Sn-2位棕榈酸含量高的配方奶粉喂养的婴儿，其粪便中钙的含量明显降低，也证明了Sn-2位棕榈酸对钙的吸收有促进作用。Nelson等[6]也采用了类似的实验，证实了高含量Sn-2位棕榈酸的配方奶粉有助于婴儿对钙的吸收。而研究表明人乳中棕榈酸作为主要饱和脂肪酸，在Sn-2位上的占比高达70%[7，8]；而牛乳中棕榈酸在Sn-2位上的比例约为32%[9]。所以，提高婴幼儿配方奶粉中Sn-2位棕榈酸的含量，使其更接近人乳，也是婴幼儿配方奶粉发展的方向。

国内外对脂肪酸在甘油三酯上分布的研究已经很多，基本原理都是采用专一的胰脂肪酶或化学试剂选择性的水解甘油三酯，得到Sn-2位上的脂肪酸，再通过不同技术分离提取，衍生脂肪酸甲酯后用气相色谱定量分析。Brockerhoff[10]采用格氏试剂将甘油三酯水解形成Sn-1，2和Sn-2，3甘油二酯，再用磷脂酶A2进行水解，得到Sn-2位上的脂肪酸，再采用薄层色谱（TLC）分离得到Sn-2位上酶解得到的脂肪酸，衍生后，用气相色谱（GC）对脂肪酸组成进行测定。此方法经过研究人员多次改进，但操作步骤还是繁琐，耗时耗力；韩瑞丽等[11]用猪胰脂酶水解，得到Sn-2位单甘酯，再采用高效液相-蒸发光散射检测法分离出Sn-2位单甘酯，衍生后，用GC测定；贾云虹等[12]同样使用猪胰脂酶水解，用反相高效液相色谱法作为分离Sn-2位单甘酯的方法，再用GC测定；这两者都采用仪器作为分离方法，分析成本大、时间长，不适合大批量样品。

本研究采用氨基固相萃取柱（NH2-SPE）分离单甘酯，既解决了TLC操作繁琐，耗时耗力的缺点，检测成本也不高，适用于日常检测分析，处理方法简单、准确、快速。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

正己烷、丙酮为色谱纯，其他试剂均为分析纯；猪胰脂酶、三羟甲基氨基甲烷、37 种脂肪酸甲酯标准品均购于Sigma公司；氨基固相萃取柱（6cc）购于Waters公司和Agela公司。

7890A气相色谱仪购于Agilent公司；离心机购于B e c k m a n Coulter 公司。

1.2 样品预处理

1.2.1 脂肪提取

采用碱性乙醚石油醚方法提取奶粉中的脂肪。此方法是公认的提取脂肪方法，提取效率高，操作简单。

1.2.2 Sn-2位脂肪酸的测定

称取已提取的油脂20 mg于10 mL试管中，加入1 mol/L三羟基甲基氨基甲烷/盐酸缓冲水溶液（pH 值8.0）2 mL，2.2%氯化钙水溶液0.2 mL，1 g/L胆酸钠水溶液0.5 mL，混合均匀，40 ℃下水浴1 min，再加入胰脂肪酶20 mg，混匀后继续水浴3 min，在自来水下冷却，添加6 mol/L盐酸溶液1 mL和乙醚2 mL，混匀，4 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液45 ℃下氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解，备用。依次用5 mL丙酮和正己烷活化氨基柱（Waters 500 mg/6 mL），将上述1 mL酶解产物上样，用15%丙酮/正己烷（v/v）5 mL淋洗，50%丙酮/正己烷（v/v）5 mL洗脱，收集洗脱液，45 ℃下氮气吹干。在上述分离产物中加入1 mol/L氢氧化钾/甲醇溶液0.7 mL，混匀，置于60 ℃水浴中振荡3 min，待冷却至室温，加入14%三氟化硼/甲醇（v/v）溶液1 mL，混匀，置于60℃水浴中反应30 min，待冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液2 mL和正己烷1 mL，混匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液，气相色谱检测。

1.2.3 总脂肪酸的测定

称取已提取的油脂20 mg于10 mL试管中，加入1 mol/L氢氧化钾/甲醇溶液0.7 mL，混匀，置于60 ℃水浴中振荡3 min，待冷却至室温，加入14%的三氟化硼/甲醇（v/v）溶液1 mL，混匀，置于60 ℃水浴中反应30 min，待冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液2 mL和正己烷1mL，混匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液，气相色谱检测。

1.2.4 气相色谱仪检测条件

色谱柱：supeclo 2560（100 m×250 μm×0.20 μm）；进样口温度：240 ℃；分流比10:1；进样量1 μL。程序升温：初始温度60 ℃（保持2 min），以15 ℃/min升至100 ℃，再以3 ℃/min升至230 ℃（保持18 min）。载气（N2）：1.0 mL/min；检测器温度：250 ℃；H2流速：40 mL/min；空气流速：400 mL/min。

表1 NH2-SPE分离步骤

2 结果与讨论

2.1 Sn-2位脂肪酸的分离

本方法采用Wares公司NH2-SPE作为分离手段，调整洗脱溶剂的极性，将Sn-2甘单脂分离收集。以硬脂酸、棕榈酸单甘酯、硬脂酸甘油二酯、硬脂酸甘油三酯作为代表，用NH2-SPE柱不同比例的洗脱溶剂分离，氮气吹干，衍生后，测定是否含有棕榈酸来确定只有甘油单酯洗脱下来的溶剂比例，结果见表1。根据棕榈酸的检测结果，最终确定丙酮:正己烷（15:85，v/v）作为淋洗溶剂，丙酮:正己烷（50:50，v/v）作为洗脱溶剂。本实验还考察了不同公司NH2-SPE对实验的影响，发现Agela公司和Waters公司最佳洗脱梯度有差别，见表1。

2.2 方法回收率和精密度实验

称取20 mg婴幼儿配方奶粉中提取的脂肪，定量加入1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）标准品2 mg，设5 个平行，按本方法处理后进行气相色谱检测，计算回收率和相对标准偏差（RSD）值。结果见表2，可知回收率在81.85%～88.9%，RSD在5%以下，重现性较好，结果较为稳定。

2.3 薄层色谱法和 NH2-SPE的数据对比

对同一婴幼儿配方奶粉，分别采用国标GBT 24894—2010方法和本方法检测分析比较Sn-2位棕榈酸占总棕榈酸含量，结果见表3。数据显示两种方法的结果较为接近，但相对国标采用的TLC分离方法，NH2-SPE作为分离方法，具有操作步骤简单，用时少的优点。

2.4 样品结果

现售婴幼儿配方奶粉中有部分产品通过添加精炼植物油或OPO来提高棕榈酸在甘油三酯2 位上所占的比例，从而促进牛乳中钙、镁、脂肪等营养物质的吸收。

采用本方法对市售的奶粉进行检测分析，结果见表4。结果表明：样品1～3配方奶粉中未添加结构油脂，刘彪等[14]测定的普通配方奶粉Sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的含量为25%～30%，样品1～3配方奶粉中Sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的含量为22%～28%；样品4～6在配方奶粉中添加精炼植物油，Sn-2位棕榈酸占总棕榈酸的含量提高至33%～37%；样品7～11在配方奶粉中添加OPO，Sn-2位棕榈酸占总棕榈酸百分比含量提高至41%～46%。配方奶粉中添加精炼植物油和OPO都可以有效提高Sn-2位棕榈酸是含量，添加OPO的效果更明显。