黄粉虫酶解物体内外抗氧化及免疫活性研究

刘竹青 李 岩 崔旋旋 朴美子*

（1青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛 266109 2青岛海润农大有限检测公司 山东青岛 266109）

黄粉虫（Tenebrio molitor）又叫面包虫，是一种富含蛋白质的昆虫，干燥的黄粉虫幼虫含蛋白质高达40%，有“蛋白质饲料宝库”的称号。研究发现，黄粉虫能很好地提高人体免疫力，降低人体血脂，延缓器官衰老。李奕冉等[1]研究了黄粉虫蛋白对小鼠免疫功能的影响，结果表明黄粉虫蛋白可以明显增加小鼠免疫器官质量，增强小鼠细胞免疫力。

蛋白质经过酶解后得到分子质量小，具有生物活性的多肽类物质。多肽类物质的活性主要表现在降血压、降胆固醇、抗肥胖、抗氧化和免疫调节等[2-3]。张莉莎等[4]利用阳阴离子交换柱层析以及Sephadex G-25凝胶柱层析对酶解得到的多肽进行分离纯化，发现纯化后的多肽表现出很强的抗氧化性。Jolles等[5]利用胰蛋白酶酶解人乳蛋白，分离出一种具有免疫活性的肽，可以刺激巨噬细胞吞噬绵羊红细胞。徐鑫等[6]采用胰蛋白酶酶解酪蛋白酸钠的方法制备免疫活性肽，获得的多肽刺激脾细胞增殖能力最强，能提高机体免疫力的活性。目前对抗氧化活性肽的研究较多集中在大豆肽和玉米肽上，对黄粉虫的利用还局限在黄粉虫蛋白质的提取上[7]，而对黄粉虫酶解物（Tenebrio Molitor Hydrolysate，以下简称TMH）的抗氧化活性及免疫活性的研究还很少。本文对TMH体外抗氧化活性进行研究，并通过小鼠试验研究了TMH的体内抗氧化活性和免疫活性，为黄粉虫功能性食品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄粉虫酶解物（TMH），自制；雄性昆明种8周龄SPF级实验小鼠〔合格证号SCXKL（鲁）20140007〕，青岛大任富城畜牧有限公司；基础饲料，青岛大任富城畜牧有限公司；D-半乳糖，国药集团；MDA、T-SOD、GSH-Px、CAT、·OH 试剂盒、考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、白细胞介素 4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ）小鼠 ELISA 测定试剂盒，南京建成生物工程公司。

1.2 仪器与设备

UV-2000型紫外分光光度计，尤尼克（上海）仪器有限公司；AR1140型电子分析天平，奥豪斯集团；台式酸度测定仪，北京哈纳科仪科技有限公司；ELx808型酶标仪，美国BioTek公司；DSHZ-300A型旋转式恒温振荡器，江苏国华电器有限公司；电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器有限公司；RE-6000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FD-1D-80冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机，湖南湘仪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TMH的制备 将黄粉虫幼虫干燥后粉碎，过100目筛子，脱脂。利用Arazyme酶酶解，加酶量为517.8 U/g原料，料水比为1∶26.05，酶解时间5.0 h。灭酶15 min后，过滤、离心，取上层离心液即TMH，冷冻干燥后备用。

1.3.2 TMH体外抗氧化活性

1）DPPH自由基清除能力测定 参考文献[8]。

2）超氧阴离子清除能力测定 采用邻苯三酚自氧化法测定[9]。

3）总还原能力测定 采用铁氰化钾法测定[10]。

1.3.3 TMH体内抗氧化活性研究

1.3.3.1 小鼠的分组与饲喂 选取60只初始体重为18～22 g的8周龄雄性昆明种SPF级小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为空白组、D-半乳糖致衰老模型组（简称为模型组）、VC阳性对照组以及TMH低剂量组、中剂量组、高剂量组。其中，空白组皮下注射 0.1 mL/（10g·d）生理盐水，其余各组皮下注射 200 mg/（kg bw·d） D-半乳糖[11]（D-半乳糖以无菌生理盐水配成20 mg/mL的溶液，使用前用0.22 μm滤膜过滤除菌）。空白组和模型组每日灌胃等体积的生理盐水，VC阳性组小鼠灌胃 VC〔10 mg/（kg bw·d）〕溶液，TMH 的低、中、高剂量组每日按多肽含量100，300，500 mg/（kg bw·d）灌胃小鼠。每日定时灌胃，注射 1次，连续6周。期间观察小鼠体征，每周记录1次小鼠体重。

1.3.3.2 小鼠的处死及血浆准备 对试验小鼠末次注射后，禁食12 h，眼球取血并处死，血液中加入抗凝剂，静置3 h，3 000 r/min离心15 min，小心吸取上层血浆，分装后液氮冷冻备用。

1.3.3.3 肝脏组织匀浆的制备 取解剖后小鼠肝脏，用生理盐水冲洗干净，沥干水分，称取0.2 g放入组织研磨器中，加入9倍生理盐水进行研磨，制成10%肝脏组织匀浆。

1.3.3.4 小鼠肝脏组织蛋白质含量测定 采用蛋白质定量试剂盒（考马斯亮蓝法）测定小鼠肝脏组织的蛋白质含量。

1.3.3.5 小鼠血浆和肝脏组织抗氧化指标的测定按照试剂盒提供的方法，分别测定小鼠血浆和肝脏匀浆中 MDA 含量，CAT、GSH-Px、T-SOD 活力以及抑制羟自由基能力。

1.3.4 TMH免疫活性研究

1.3.4.1 实验动物的分组与饲喂 选取40只初始体质量18～22 g的8周龄昆明种清洁级雄性小鼠，随机分为4个处理组，分别为空白组，TMH的低、中、高剂量组，每组10只。低、中、高剂量组每日按 TMH 中多肽含量 100，300，500 mg/（kg bw·d）灌胃小鼠，空白组每日灌胃等体积的生理盐水，各组小鼠自由取食和饮水，饲养30 d。

1.3.4.2 小鼠致敏及血清制备[12]取公鸡血置于装有玻璃珠的三角瓶中，同一方向摇动脱纤维，用生理盐水清洗 2～3 次，离心（2 000 r/min，10 min），取上清，用生理盐水配制体积分数为2%的鸡红细胞悬液。每只小鼠腹腔注射鸡血红细胞0.2 mL，5 d后眼球取血，将凝固血与离心管壁剥离，使血清充分析出，以2 000 r/min离心10 min，收集血清。

1.3.4.3 肝脏组织匀浆的制备 小鼠饲养30 d后，称小鼠体重，眼部取血后处死，分别摘取小鼠的胸腺与脾脏，用生理盐水冲洗，用滤纸充分吸干内脏表面的水分，称取小鼠各脏器质量并记录数据，计算免疫器官指数（g/kg体重）。

1.3.4.4 小鼠血清中免疫功能指标的测定 采用酶联免疫吸附法测定小鼠血清中的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、白细胞介素 4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ），试验遵循 ELISA 测定试剂盒操作步骤。

1.3.5 数据处理 数据采用x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，统计组间差异。

2 结果与分析

2.1 TMH体外抗氧化活性

2.1.1 TMH对DPPH自由基的清除作用由图1可看出，在2～10 mg/mL质量浓度范围，随着TMH浓度的增大，其对DPPH自由基的清除率也增大，当TMH的质量浓度为10 mg/mL时，其清除率达88.4%，其 IC50为 3.75 mg/mL。

图1 不同浓度TMH对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH scavenging ability of TMH with various concentrations

2.1.2 TMH对O2-·自由基的清除作用由图2可以看出，在25～200 mg/mL质量浓度范围，TMH浓度与清除O2-·自由基的能力呈线性关系。随着TMH浓度的增大，其清除率不断增大，当质量浓度为200 mg/mL时，其清除率达61.0%，IC50为138.42 mg/mL。

2.1.3 TMH的还原能力 由图3可以看出，在0.5～6 mg/mL质量浓度范围，随着黄粉虫酶解物浓度的增大，其还原能力不断增大。当质量浓度为6 mg/mL时，其还原能力达到0.653。

2.2 TMH体内抗氧化活性

2.2.1 TMH对小鼠体重的影响 体重的改变反映衰老的程度。对实验小鼠在正常饲喂条件下连续饲喂6周，每周记录小鼠体重1次。数据表明，饲喂期间各组小鼠的体重都有增加，其中模型组小鼠的体重增加量显著小于其它各剂量组。研究发现小鼠体重增加量与TMH剂量的增加呈正比关系，多肽高剂量组的体重增加量与正常组无显著差异，说明TMH可减缓衰老模型小鼠的衰老症状，起到防衰老的效果。

图2 不同浓度TMH对O2-·自由基清除能力Fig.2 O2-·radical scavenging ability of TMH with various concentrations

图3 不同浓度黄粉虫酶解物的还原能力Fig.3 Reducing capacity of TMH with various concentrations

表1 TMH对小鼠体重的影响Table1 Effect of TMH on body weight of mice

2.2.2 TMH对小鼠血浆中MDA含量、CAT、GSHPx、T-SOD活力及抑制羟自由基能力的影响 机体组织中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等可以清除体内自由基和脂质过氧化物，并明显抑制组织中的丙二醛，从而抑制自由基的产生。小鼠组织中CAT、GSH-Px、T-SOD 活力及抑制羟自由基能力以及小鼠体重和肝脏中MDA含量变化，可以反映小鼠机体抗氧化情况。由表2可看出，模型组小鼠注射D-半乳糖后，肝脏MDA含量显著升高，同时CAT、T-SOD、GSHPx活力和抑制羟自由基能力显著降低，D-半乳糖建立衰老模型成功。与模型组相比，高剂量组TMH可以显著降低MDA（P<0.05）含量并抑制羟自由基能力；低剂量组TMH就可以显著提高小鼠血浆、肝脏中CAT（P<0.05）活力；中剂量组TMH可以显著提高GSH-Px（P<0.05）活力；当TMH为高剂量组时，可以显著提高小鼠血浆、肝脏中TSOD（P<0.05）活力，其中，随着剂量的增加，各指标与模型组的差异增大，并与空白组的指标接近。

表2 TMH对小鼠血浆中MDA含量、CAT、GSH-Px、T-SOD活力及抑制羟自由基能力的影响Table2 Effect of TMH on MDA，CAT，GSH-Px，T-SOD and OH·in mice’s plasma

2.2.3 TMH对小鼠肝脏中MDA含量、CAT、GSHPx、T-SOD活力及抑制羟自由基能力的影响 由表3可看出，模型组小鼠注射D-半乳糖后，肝脏MDA 含量显著升高，同时 CAT、T-SOD、GSHPx活力和抑制羟自由基能力显著降低，说明用D-半乳糖建立衰老模型成功。与模型组相比，TMH高剂量组的小鼠肝脏中MAD含量和T-SOD活力有显著的变化，低、中剂量组没有显著性改变；CAT活力在低、中、高剂量组中都有所降低，变化均不显著；TMH中剂量组中GSH-Px活力和·OH清除能力比模型组显著提高，与空白组无显著性差异。

表3 TMH对小鼠肝脏中MDA含量、CAT、GSH-Px、T-SOD活力及抑制羟自由基能力的影响Table3 Effect of TMH on MDA，CAT，GSH-Px，T-SOD and OH·in mice’s liver

2.3 TMH免疫活性研究

2.3.1 TMH对小鼠免疫器官指数的影响 胸腺和脾脏分别属于中枢和外周免疫器官，其增重往往意味着机体淋巴细胞的增殖，直接体现免疫应答的强弱[13]。由表4可知，与对照组比较，随着TMH剂量的增加，小鼠的免疫器官指数也有相应的变化，其中胸腺指数没有显著变化，脾脏指数变化显著。低、高剂量间不存在明显的量效关系，其原因有可能是小鼠的胸腺与脾脏较小，解剖时导致测定结果有一定误差。同时，剂量设计跨度大也有待改进。

表4 TMH对小鼠免疫器官指数的影响Table4 Effect of TMH on the immune organs index of mice

2.3.2 TMH 对小鼠血清中 IgG、IgM、IL-4、IFN-γ含量的影响 血清中的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量代表血清中免疫球蛋白的主要水平，是反映机体免疫功能状态的指标[14]。由表5可知，小鼠血清中的IgG含量在低、中、高剂量组间差异显著，而小鼠血清中的IgM含量在低、中、高剂量组间没有明显差异。与空白组相比，小鼠血清中IgG、IgM含量均有显著性提高。这说明TMH通过提高小鼠血清中IgG、IgM含量，提高小鼠免疫能力的效果。

细胞因子IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞都有免疫调节作用，主要参与B细胞增殖以及体液免疫，抗体的产生。细胞因子IFN-γ主要促进T细胞增殖，介导细胞免疫和炎症反应。由表5可知，与空白组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中的IFN-γ含量有显著提升，而中、高剂量组组间并无差异性。与空白组相比，低剂量组小鼠血清中的IL-4含量提高显著。随着饲喂剂量的增加，血清中的IL-4含量也显著提高，并呈正相关性。TMH可以显著提高小鼠血清中IL-4的含量，从而提高IL-4参与体液免疫能力，诱导抗体产生，提高小鼠免疫力。

表5 TMH对小鼠血清中IgG、IgM、IL-4、IFN-γ含量的影响Table5 Effect of TMH on the IgG，IgM，IL-4，IFN-γ concentrations in mice’s plasma tissue

3 结论

利用Arazyme酶酶解黄粉虫，得到富含多肽的酶解液。通过体外抗氧化活性研究发现，黄粉虫酶解液对DPPH自由基、O2-·自由基的清除能力分别达到 88.4%（10 mg/mL），61.0%（200 mg/L），且当其质量浓度为6 mg/L时，还原能力达到0.653。

动物试验表明，TMH可以显著提高小鼠血浆、肝脏中 CAT、GSH-Px、T-SOD（P<0.05）活力，降低MDA（P<0.05）含量并抑制羟自由基能力；显著增加血清中 IgG、IgM、IL-4、IFN-γ（P<0.05）的含量，提高小鼠脾脏和肝脏指数，表现出较强的抗氧化能力以及改善机体免疫的功能。