一种中华绒螯蟹病原——腐败希瓦氏菌

尹晓静，周静华，王杰

（苏州市相城区水产技术推广站，江苏 苏州 215131）

中华绒螯蟹是苏州地区的主要水产养殖品种之一。在养殖过程中，部分养殖户塘口的中华绒螯蟹出现了活力下降甚至死亡的情况，造成了较大的损失。从患病蟹体内分离到腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）并人工回感成功，该文有关腐败希瓦氏菌及其药物敏感性的结果有助于对中华绒螯蟹的细菌性疾病进行预防和治疗。

1 材料与方法

1.1 中华绒螯蟹

患病蟹来自相城区阳澄湖镇的发病蟹塘，规格60～80 g，病蟹十肢无力，行动迟缓，血液凝固慢或不凝。人工回感试验所用健康蟹购自阳澄湖镇养殖池塘，平均体质量62 g/只。

1.2 主要试剂和仪器

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、麦康凯琼脂（MCKA）、RS琼脂（RSA）（北京陆桥技术有限责任公司）；药敏板（南京菲恩医疗科技有限公司）；E/NF生化鉴定板条、BBL Crystl微生物鉴定系统、比浊仪（Becton,Dickinson and Company,USA）。

1.3 细菌分离

将病蟹在自来水中洗刷外壳，并用干净纱布吸干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，取肝脏在TSA平板上划线分离，28℃恒温培养箱中培养24 h，从平板上形态一致的优势菌落中选取单个菌落，再次TSA平板划线，直至获得细菌纯培养物。再取单个菌落分别划线于MCKA平板和RSA平板，28℃恒温培养箱中培养24 h，观察菌落生长情况。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 生化鉴定 将分离菌纯培养物划线MCKA平板，28℃恒温培养箱中培养20～24 h，挑取菌苔至0.85%NaCl生理盐水中，用比浊仪配制成0.5麦氏浓度菌液，菌液接入E/NF生化鉴定板条，28℃恒温培养箱中培养20h，板条通过BBL Crystl微生物鉴定系统进行鉴定分析。

1.4.2 PCR扩增与测序 分离菌株16S rDNA的PCR扩增与序列分析委托苏州泓迅生物科技有限公司完成。

1.5 人工感染

健康蟹分放在5个中转箱（长×宽×高=60 cm×40 cm×30 cm，水深 10cm）中，充氧，不投饵，室温空调维持27～28℃，暂养3 d，弃去伤残体弱，开始试验。设4个试验组，每组10只蟹。采用肌肉注射法，每组注射分离菌液浓度分别为 2×108、1×108、0.5×108、0.25×108CFU/mL，每只 0.1mL。同时设一对照组，注射同等量无菌生理盐水，48h后观察结果并记录蟹发病死亡情况。对刚死的蟹立即进行细菌分离，如果重新分离到接种菌株且为优势菌株，即可以确定蟹发病死亡是由该菌株造成。采用改良寇氏法计算分离菌株对河蟹的LD50。

1.6 药敏试验

采用南京菲恩医疗科技有限公司生产的药敏板对分离菌进行药物敏感性测定，选用抗生素如下：恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、红霉素、盐酸环丙沙星、盐酸土霉素、强力霉素。

2 结果

2.1 细菌分离

从两病蟹肝脏分离出12株优势菌株，取代号为SP25。TSA平板培养24 h后可见各优势菌株呈现出相同的菌落形态：菌落圆形，直径1～2 mm，边缘整齐，轻度凸起，表面湿润、光滑，不透明。菌落在TSA、MCK和RSA平板上均生长良好，分别呈淡黄色、黄色和黑色。

2.2 细菌鉴定

2.2.1 生化分析 通过BBL Crystl微生物鉴定系统的生化分析，菌株SP25鉴定为腐败希瓦氏菌。

2.2.2 序列分析 通过对菌株SP25的16S rDNA的PCR扩增与测序，获得一段长1 430 bp的序列（GenBank登录号为 JN555612）。Blast比对结果显示，菌株SP25与GenBank数据库中检出的16株Shewanella putrefaciens菌株的相似度均大于98%。

综合生化分析和序列分析，菌株SP25鉴定确定为腐败希瓦氏菌。

2.3 人工感染

SP25菌株的人工回感河蟹试验结果见表1。从表1可见，在感染SP25菌株后48 h，3.23×105CFU/g剂量组的蟹病死率达100%，0.40×105CFU/g剂量组的蟹病死率为20%，而对照组的蟹在试验期间无病状和死亡。感染发病的蟹活力下降、附肢无力，不久便死亡。从刚死亡的病蟹中分离到大量与SP25菌株菌落形态一致的优势菌株（RSA平板培养菌落呈黑色，BBL Crystl微生物鉴定系统鉴定为腐败希瓦氏菌）。测得SP25菌株感染河蟹48 h的LD50为6.17×104CFU/g。

2.4 药敏试验

药物敏感性测试结果见表2。表2可见，菌株SP25对恩诺沙星、硫酸新霉素、盐酸环丙沙星较为敏感，对甲砜霉素耐药。

表1 菌株SP25对河蟹的人工感染试验

表2 菌株SP25药物敏感性测试mg/L

3 讨论

近年，国内外相继发现有腐败希瓦氏菌感染金带篮子鱼（Siganus rivulatus）[1]、欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）[2]、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[3]以及大菱鲆（Scophthalmus maximus）[4]等海水养殖动物的研究报道。作为水产动物的病原菌，却较少见到腐败希瓦氏菌感染淡水养殖动物的报告，国外目前仅见 Kozi ska等[5]所发现的鲤鱼（Cyprinus carpio）和鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的感染病例，国内也仅见腐败假单胞菌感染河蟹[6]和腐败希瓦氏菌感染异育银鲫（Carassius auratus gibelio）[7]的有关研究报道。对河蟹进行的人工回感试验结果表明，分离到的腐败希瓦氏菌能使健康河蟹致病死亡，病蟹表现出与自然状态下感染腐败希瓦氏菌相似的临床特征，同时从发病死亡的蟹体内又重新分离到了该菌株，根据Koch法则，可以确定腐败希瓦氏菌即是导致河蟹发病死亡的致病菌。

腐败希瓦氏菌是冰鲜鱼的主要腐败菌[8-10]，该试验采集的病蟹也主要是投喂冰鲜鱼饵料，因此，在河蟹养殖中，倡导养殖户使用颗粒饲料替代冰鲜鱼，或冰鲜鱼经消毒杀菌处理后再投喂，能有效避免腐败希瓦氏菌的感染，减少养殖户的经济损失。