幽门螺杆菌UreB蛋白对小鼠的免疫调节作用

张惠娟，余飞艳，张荣光，段广才

1.海南医学院第一附属医院医疗保健科，海南 海口 570102； 2.郑州大学公共卫生学院

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)在全球人群的感染率超过50%，H.pylori感染可引起包括胃癌在内的多种胃肠疾病和肠外疾病，其致病机制不明，抗生素治疗H.pylori感染面临抗药性不断升高的挑战，而相关疫苗虽有进入临床试验报道，但事实上至今仍无商品化产品问世，因此，H.pylori感染流行的防治已成为重大公共卫生问题[1-4]。H.pyloriUreB蛋白既是细菌的主要毒力因子，也是重要的保护性抗原[5-6]。目前，有研究显示，用UreB免疫人和实验动物均可产生免疫保护效果，但其机制尚不明确[7]。因此，本研究初步探讨UreB对小鼠的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1H.pyloriUreB蛋白制备采用本室前期构建的重组菌株E.coliTB1/pMAL-c2x-UreB，用IPTG诱导重组菌株表达UreB，并通过多糖树脂亲和层析纯化重组蛋白(rUreB)，将纯化产物置于-80 ℃储存备用[8]。

1.2 试剂和实验动物采用双色标记的单抗CD4+FITC/CD3+PE(Serotec Co.)和FACS溶血素(晶美生物公司)进行流式细胞分析。3周龄雄性昆明小鼠由河南省实验动物中心提供，饲养1周后，用于免疫实验。

1.3 动物分组及处理将实验动物随机分成实验组和对照组，实验组(n=20)经背部皮下注射重组蛋白液100 μl (0.50 g/L)，对照组(n=20)注射等体积过柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L β巯基乙醇)。

1.4 血液样品采集于注射UreB后1周和2周，每组分别抽取7只和13只小鼠，经眼球采集血液。对采血用的1.5 ml EP管预先用质量浓度为38 g/L的枸橼酸钠溶液浸润处理，并于临用前在管底预加30 μl此溶液。在血液滴入后，温和振荡，使枸橼酸钠与血液充分混匀，用于后续流式细胞检测。

1.5 血液白细胞(WBC)和红细胞(RBC)计数采用临床血常规自动化检测设备，对小鼠抗凝血中WBC和RBC进行计数。

1.6 流式细胞检测取100 μl抗凝血，加入8 μl CD4+FITC/CD3+PE单抗(商品打开包装后，用1 ml蒸馏水稀释，10 μl/test×100 tests)，混匀，避光孵育30 min。加入1×FACS溶血素2 ml混匀，室温，避光孵育15 min，至液体澄清透明。然后1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入2 ml PBS洗液(PBS+质量浓度为10 g/L的FBS+质量浓度为1 g/L的NaN3)混匀，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。将细胞悬浮于0.5 ml PBS洗液中，振荡混匀，用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1H.pyloriUreB蛋白应用本课题组前期报道重组菌株和方法[8]，从重组菌诱导表达产物中纯化得到rUreB蛋白，纯化产物纯度约为90%。实验过程中均无小鼠死亡。

2.2 动物免疫免疫实验组和对照组小鼠均完成实验过程。每只小鼠经摘眼球采血300～400 μl。实验过程中均无小鼠死亡。

2.3 全血细胞计数小鼠抗凝血WBC计数结果显示，实验组WBC计数高于对照组，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。RBC计数结果显示，两组的RBC均数差异无统计学意义(见表1)。

表1 小鼠血液WBC和RBC计数Tab 1 WBC and RBC counts of the mice blood samples

2.4 流式细胞分析流式检测结果显示，在免疫后1周，rUreB免疫组小鼠CD3+CD4-T淋巴细胞(CD4-)和CD3+T淋巴细胞(CD3+)在总淋巴细胞(LC)中各自所占构成比均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而在免疫后第2周，此指标差异不再具有统计学意义(见表2)。

表2 H.pylori rUreB免疫小鼠血液淋巴细胞亚群与总淋巴细胞比值Tab 2 Ratio of lymphocyte subgroup and total lymphocytes in mice immunized with H.pylori rUreB protein

注：与Buffer组相比，△P<0.05；CD4+：CD3+CD4+T淋巴细胞；CD4-：CD3+CD4-T淋巴细胞；CD3+：CD3+T淋巴细胞；LC：总淋巴细胞。

免疫实验组CD4+CD3+T淋巴细胞与CD4-CD3+T淋巴细胞比值、CD3+CD4+T淋巴细胞与CD3+T淋巴细胞比值与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

免疫实验组CD3+CD4+T淋巴细胞与WBC比值、CD3+CD4-T淋巴细胞与WBC比值、CD3+T淋巴细胞与WBC比值与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表3 H.pylori rUreB免疫小鼠血液不同淋巴细胞亚群比值Tab 3 Ratio of lymphocyte subgroups in mice immunized with H.pylori rUreB

表4 H.pylori rUreB免疫小鼠血液淋巴细胞亚群与WBC比值Tab 4 Ratio of lymphocyte subgroups and WBC in mice immunized with H.pylori rUreB

3 讨论

已有研究显示，H.pylori某些抗原具有影响宿主免疫功能的作用，其中包括改变宿主免疫细胞亚群比势。例如，H.pyloriOmp18蛋白能够显著提高树突状细胞的MHC Ⅱ类抗原和共刺激因子CD83的表达，促进树突状细胞发育成熟和Th1/Th2类免疫反应，进而提升人体CD4+T细胞数量；H.pylori中性粒细胞激活蛋白(NapA)具有促进Th2型免疫反应向Th1型转化的免疫调节功能，在抗过敏和抗肿瘤研究中具有潜在应用价值[9-10]。然而，关于H.pyloriUreB蛋白免疫调节活性的研究尚少有报道。

H.pylori主要定植于人体胃黏膜黏液层，生存于酸性较强的环境中。H.pylori尿素酶是菌体分泌产生的主要功能蛋白，可以分解消化道内的尿素产生氨，藉此中和菌体周围环境中的胃酸，使菌体得以长期在胃内存活。H.pylori尿素酶由UreB和UreA两种亚单位构成，其中，UreB具有良好的免疫原性且毒性较UreA低，因此常被用作疫苗抗原[11]。据报道，UreB与黏膜免疫佐剂LTB经口免疫实验动物，可增强动物对H.pylori攻击的免疫反应，产生明显的免疫保护效果[12]。研究提示，UreB蛋白可能在H.pylori感染免疫和致病机制中具有重要作用。目前，H.pylori感染致病机制和免疫保护机制不明是制约H.pylori感染防治研究发展的关键因素，因此，本研究探讨UreB对宿主免疫的影响具有重要意义。

已有研究基于建立黏膜免疫保护目的，多将H.pyloriUreB蛋白与黏膜佐剂混合，经口免疫实验动物。这种免疫方法适用于口服疫苗免疫效果的鉴定，但不利于对UreB蛋白免疫调节活性的分析[13]。经皮下注射UreB蛋白可以减少黏膜佐剂和胃肠环境因素对UreB蛋白生物效应的混杂作用，因此，本研究采用经皮下注射UreB蛋白的免疫途径。

本研究发现，虽然H.pyloriUreB免疫组小鼠血液RBC和WBC计数与对照组比较，差异无统计学意义，但在免疫后1周，免疫组小鼠的CD4-CD3+T细胞与总淋巴细胞比值、CD3+T细胞与总淋巴细胞比值均显著低于对照组。研究表明，H.pyloriUreB对宿主免疫细胞亚群的构成比具有调节作用。由于CD4-CD3+T细胞中主要是CD8+CD3+T淋巴细胞亚群，且该亚群以抑制性T细胞(Ts)和细胞毒性T细胞(Tc)为主，因此，UreB降低小鼠的CD4-CD3+T细胞与总淋巴细胞比值可能是UreB增强宿主抗H.pylori感染免疫机制之一。

在免疫后第2周，免疫组小鼠的CD4-CD3+T细胞与总淋巴细胞比值、CD3+T细胞与总淋巴细胞比值均与对照组比较差异无统计学意义，研究提示，H.pyloriUreB对宿主免疫细胞亚群的构成比的调节作用具有明显的时效性特征。这种时效性的存在给研究提出一个问题：类似UreB的H.pylori保护性抗原可能对宿主的免疫调节效果相当短暂，例如，本研究发现，UreB的调节效果仅持续约1周时间，鉴于此，未来研究如何提高其免疫调节作用并长期维持免疫效果？这个问题值得在后续研究中进行深入探讨。

总之，本研究通过用H.pyloriUreB蛋白经皮下免疫小鼠实验，鉴定了该蛋白对小鼠免疫细胞亚群数量比值的影响，发现其具有免疫调节作用，研究结果为H.pylori感染免疫和致病机制研究奠定了重要基础。