鸡矢藤提取物对2 型糖尿病大鼠胰腺β 细胞内质网应激的影响

徐 锦, 梁志敏, 刘智君, 梁 韬, 郑 妮, 陈 欢*

(1.玉林市中西医结合骨科医院,广西 玉林537000；2.广西医科大学附属口腔医院,广西 南宁530021；3.南方医科大深圳医院,广东深圳518000)

糖尿病是一种由多种病因造成机体内高血糖的慢性代谢性紊乱疾病,发病率随着人们生活质量提高、生活方式及饮食结构改变而升高,据国际糖尿病基金会预计,2030年我国糖尿病患者将增加到1.3 亿,占总人口12.1%［1］。2型糖尿病约占糖尿病患者总数的80%,而机体外周组织胰岛素抵抗、胰岛β 细胞功能衰竭是其发展的两大重要环节。胰岛β 细胞具有高度发达的内质网,对内质网应激极为敏感,故其所诱导的细胞凋亡是细胞功能衰竭的重要因素［2-3］,也是2 型糖尿病发病的重要环节。由于糖尿病是以高血糖为基本特征的全身性疾病,发病过程中会出现许多并发症,对患者、家庭、社会造成了不小的经济负担及压力,故研发具有靶向性的相关药物有着重要现实意义。

鸡矢藤是茜草科草质藤本植物鸡矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其味甘、微苦,性平［4］,具有抗炎镇痛、抗风湿、抗痛风、降血糖等药理活性,在抗糖尿病治疗上有着良好的效果,但其作用机制尚未明确［5］。本实验考察鸡矢藤提取物对2 型糖尿病大鼠胰腺β 细胞内质网应激的影响,为深入研究其机理提供实验依据。

1 材料

1.1 试药 鸡矢藤购自广西玉林市药材市场,经广西中医药研究院专家鉴定为茜草科多年生草质藤本植物鸡矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其提取物由本实验室采用乙醇提取法制得。链脲佐菌素(STZ) 购自美国Sigma 公司,批号SO170-100 mg；二甲双胍片购自北京京丰制药有限公司,批号170622。胰岛素ELISA 试剂盒购自美国Millipore 公司,批号C17084；一氧化氮(NO)、核因子-κB(NF-κB) ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,批号1756725、1709124；活性氧(ROS) ELISA试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司公司,批号1705246；兔抗Tribble 同源蛋白3(TRIB3) 多克隆抗体购自德国Calbiochem 公司,批号17054；兔抗大鼠C/EBP 同源蛋白(CHOP) 高亲和性单克隆抗体购自美国Sigma 公司,批号BI852。

1.2 仪器 卓越型血糖仪,购自瑞士罗氏公司；电泳仪,购自美国Bio-Rad 公司；9602A 酶标仪,购自北京艾普生物设备有限公司。

1.3 动物 SPF 级SD 大鼠,体质量(200±20) g,雌雄各半,由广西医科大学实验动物中心提供,合格证号SCXK(桂)2015-0005。

2 方法

2.1 造模、分组及给药［6］大鼠造模前12 h 禁食不禁水,尾静脉注射链脲佐菌素(60 mg/kg) 后高脂饲料喂养30 d。第31 天尾部取血,测定空腹血糖,以≥11.1 mol/L 为造模成功。大鼠随机分为模型组、二甲双胍组(320 mg/kg)、鸡矢藤提取物组(1.25、2.5、5.0 g/kg),每组10 只,另设空白组10 只大鼠,普通饲料喂养,各组灌胃给药4 周。

2.2 提取物制备 药材干燥粉碎后,浸泡于10 倍量80%乙醇中1 h,75 ℃回流提取1 h,共2 次,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,真空条件下低温干燥,即得。

2.3 指标检测 血糖仪、ELISA 试剂盒法分别检测初次给药前及末次给药后1 h 大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平。末次给药前,大鼠禁食不禁水12 h,给药后1 h 腹主动脉取血,高速离心分离血清。切取大鼠胰腺部分组织,浸泡于4%甲醛中固定1 周,石蜡包埋切片,HE 染色,显微镜下观察。再切除部分胰腺组织,匀浆后ELISA 试剂盒法检测NO、ROS、NF-κB 水平,Western blot 法检测胰腺组织TRIB3、CHOP 蛋白表达。

2.4 统计学分析 通过SPSS 18.0 软件进行处理,数据以表示,方差齐者组间比较采用t 检验,方差不齐者采用矫正t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 鸡矢藤提取物对空腹血糖的影响 表1 显示,与空白组比较,模型组空腹血糖显著升高(P＜0.05)；与模型组比较,鸡矢藤提取物组空腹血糖显著下降(P＜0.05),并呈一定剂量依赖性。

表1 鸡矢藤提取物对空腹血糖的影响n=10）

表1 鸡矢藤提取物对空腹血糖的影响n=10）

注：与空白组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05

组别 (g剂·k量g-/1)给药空前腹 血糖/(mmo给l·L药-1后)空白组 — 7.56±0.84 7.41±1.08模型组 — 13.81±1.14* 14.52±1.29*二甲双胍组 0.32 13.45±1.22* 10.47±1.81*＃鸡矢藤提取物组 1.25 12.98±1.63* 11.45±1.26*＃鸡矢藤提取物组 2.5 13.26±1.49* 10.93±1.18*＃鸡矢藤提取物组 5.0 13.17±1.58* 10.38±1.46*＃

3.2 鸡矢藤提取物对大鼠胰腺组织的影响 图1 显示,空白组大鼠胰腺组织细胞结构完整饱满；模型组大鼠胰腺细胞有大量结构变形及萎缩情况,并伴有炎性细胞浸润；二甲双胍组、鸡矢藤提取物组大鼠胰岛细胞结构变形、萎缩情况有所改善,损伤胰岛有所减缓。

图1 各组大鼠胰腺组织病理变化（×400）

3.3 鸡矢藤提取物对血清胰岛素的影响 表2 显示,与空白组比较,模型组血清胰岛素水平显著降低(P＜0.05)；与模型组比较,鸡矢藤提取物组其水平显著升高 (P ＜0.05)。

表2 鸡矢藤提取物对血清胰岛素的影响n=10）

表2 鸡矢藤提取物对血清胰岛素的影响n=10）

注：与空白组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05

组别 剂量/(g·kg-1) 胰岛素/(mIU·mL-1)空白组 — 22.86±4.72模型组 — 10.73±2.05*二甲双胍组 0.32 18.45±3.81*＃鸡矢藤提取物组 1.25 13.36±4.06*＃鸡矢藤提取物组 2.5 15.09±2.79*＃鸡矢藤提取物组 5.0 18.51±2.57*＃

3.4 鸡矢藤提取物对NO、ROS、NF-κB 水平的影响 表3显示,与空白组比较,模型组NO、ROS、NF-κB 水平显著升高(P＜0.05)；与模型组比较,鸡矢藤提取物组三者水平显著降低(P＜0.05)。

3.5 鸡矢藤提取物TRIB3、CHOP 蛋白表达的影响 表4、图2 显示,与空白组比较,模型组TRIB3、CHOP 蛋白表达显著升高(P＜0.05)；与模型组比较,鸡矢藤提取物组两者蛋白表达显著下降(P＜0.05),并呈一定剂量依赖性。

4 讨论

内质网是细胞内蛋白质合成、加工修饰、质量监控的重要场所,能保持细胞内Ca2+稳态平衡,确保细胞功能正常运行［7］。内质网应激是真核细胞的一种保护性应激反应,但使内质网持续性处于应激状态时则可激活细胞的凋亡通路,触发细胞凋亡［8-9］。胰岛β 细胞具有高度发达的内质网,其蛋白质合成和分泌功能旺盛,使得β 细胞对内质网应激极为敏感,在2 型糖尿病发展中它长期处于高糖环境下,会造成其细胞内的内质网处于持续性、长期性应激反应,诱导细胞功能衰竭,减少细胞数,故内质网应激在2型糖尿病病程中可引起胰岛β 细胞功能衰竭及凋亡。

表3 鸡矢藤提取物对NO、ROS、NF-κB 水平的影响n=10）

表3 鸡矢藤提取物对NO、ROS、NF-κB 水平的影响n=10）

注：与空白组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05

组别 剂量/(g·kg-1) NO/(μmol·L-1) ROS/(U·mL-1) NF-κB/(pg·mL-1)空白组 — 0.53±0.07 216.57±21.73 86.34±7.41模型组 — 1.18±0.14* 423.98±36.17* 159.27±12.73*二甲双胍组 0.32 0.75±0.09*＃ 263.75±24.82*＃ 107.43±13.82*＃鸡矢藤提取物组 1.25 1.02±0.18* 372.66±29.05*＃ 138.26±11.09*＃鸡矢藤提取物组 2.5 0.88±0.11*＃ 313.51±27.38*＃ 112.95±13.64*＃鸡矢藤提取物组 5.0 0.71±0.13*＃ 274.25±19.89*＃ 94.56±10.75*＃

表4 鸡矢藤提取物对TRIB3、CHOP 蛋白表达的影响

表4 鸡矢藤提取物对TRIB3、CHOP 蛋白表达的影响

注：与空白组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05

组别 (g剂·k量g-/1) TRIB3 CHOP空白组 — 0.35±0.04 0.78±0.14模型组 — 0.82±0.08* 1.39±0.25*二甲双胍组 0.32 0.56±0.03*＃ 1.01±0.19*＃鸡矢藤提取物组 1.25 0.67±0.05*＃ 1.15±0.15*＃鸡矢藤提取物组 2.5 0.58±0.05*＃ 1.06±0.24*＃鸡矢藤提取物组 5.0 0.51±0.04*＃ 0.92±0.17*＃

图2 各组TRIB3、CHOP 蛋白表达

在2 型糖尿病状态下,胰岛组织中会有大量炎症因子产生,从而出现炎症级联反应,会直接或间接作用于胰腺并损伤胰岛β 细胞。NF-κB 是一种介导糖尿病炎症反应的炎症因子,起着中心调控作用,其高表达时会促进胰岛β细胞凋亡,从而导致胰岛功能障碍,出现高血糖［10］,它不仅与炎症反应密切相关,还与细胞增殖、存活有着密切关系［11］。2 型糖尿病状态下胰岛β 细胞中,NF-κB 高表达可能启动组织中iNOS 因子活性,进而诱导NO 生成,触发内质网应激反应,造成胰岛β 细胞损伤,导致细胞凋亡。

TRIB3 是重要的应激反应相关蛋白,能通过调控下游的炎症因子、氧化因子、营养因子等来参与调节细胞增殖、迁移、凋亡等功能,在内质网应激状态下抑制其表达可明显降低应激损伤所造成的细胞凋亡［12］。NF-κB 是TRIB3 蛋白下游因子,后者表达能调控前者活性［13］,在内质网应激反应时后者表达增加,可提高前者活性,促进iNOS 表达进而诱导NO 生成,造成胰岛β 细胞损伤。另外,胰岛组织中TRIB3 蛋白高表达时,能使细胞内ROS 产生量增多,引起胰岛β 细胞生物膜脂质过氧化,细胞内蛋白、酶变性,DNA 损害,从而损伤β 细胞及凋亡［14］,与本实验结果吻合。

CHOP 作为C/EBP 转录因子家族成员,是内质网应激特异的转录因子,也是由抗调亡向促调亡转换的主要信号分子。当内质网处于普通状态时,CHOP 蛋白处于低表达状态,而当受内质网应激时其表达会增加,故其可作为衡量糖尿病动物胰岛内质网应激反应的指标［15］。

本实验发现,鸡矢藤提取物能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖,提高胰岛素分泌水平,改善受损胰腺中胰岛结构及形态；胰腺组织中NO、ROS、NF-κB 水平下降,TRIB3、CHOP 蛋白表达均降低,提示其降血糖作用机制可能为下调胰腺组织TRIB3、CHOP 蛋白表达,降低下游因子NF-κB活性,减少NO、ROS 水平,延缓内质网应激对胰岛造成的损伤,从而达到治疗糖尿病的目的。