2株芽孢杆菌抗旱及解磷能力

杨莹　刘冬雪　郭英　卜宁

摘要：为给牧草专用微生物肥的研制提供菌株材料，从蒙辽交界沙化土壤中分离出2株芽孢杆菌菌株STW-2、STW-64，通过形态学观察、生理生化指标和16S rDNA测序分析进行鉴定，并对其进行抗旱解磷能力研究。结果表明，菌株STW-2为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），STW-64为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）;STW-64菌株抗旱能力明显高于STW-2菌株;STW-2菌株在培养前3 d解无机磷的能力高于STW-64菌株，最高解磷率可达9.66%，但随着培养时间的增加，STW-64菌株解无机磷能力逐渐高于STW-2菌株，培养至7 d时其解磷率可达117%，STW-2菌株在干旱胁迫下解无机磷的能力明显高于STW-64菌株;STW-2菌株在培养4 d时解有机磷效果最好，其解磷率为2.48%，STW-64菌株在干旱胁迫下解有机磷能力整体高于STW-2菌株。2株芽孢杆菌在抗旱解磷方面均表现出不同的作用效果，在改善沙化土壤磷有效性和制备牧草专用生物肥料方面具有一定的应用潜力。

关键词：芽孢杆菌;分离鉴定;抗旱;解磷

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0260-04

蒙辽交界的阜新市彰武县章古台镇位于122°22′E、42°43′N，地处科尔沁沙地东南端，年降水量450～550 mm，为细沙质荒漠化土地[1]。这种沙化土壤物理黏粒少，沙粒间隙大，保水性差，腐植质含量极低，氮、磷缺乏，土表温度升高和降低的速度快，一般不能为植物所利用[2]。磷是植物生长的必需元素之一，植物缺乏磷元素，多种代谢活动受到抑制，植株生长缓慢。土壤中磷素主要以无机磷和有机磷2种形式存在，无机磷主要以磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁3种化合物的形式存在[3]，在施撒的肥料中70%以上水溶性磷与土壤中的Ca2+、Al3+等结合形成不同形式的磷[4]，其中难溶性磷酸盐约占土壤磷酸盐总量的95%～99%[5]，不能直接被植物吸收和利用，几乎为无效态磷。土壤结构破坏，导致磷元素流失，使水体富营养化，污染环境[6]。解磷菌是能够溶解土壤中的难溶性磷并可将其转化成植物可以利用的可溶性磷的有益微生物菌群[7]，能提高土壤可利用态磷含量。本研究从沙化土壤中分离筛选具有抗旱解磷能力的菌株，探究其抗旱解磷功能，以期为沙化土壤的牧草专用菌肥研制提供良好的菌种资源，为改善营养贫瘠的沙化土壤、解决破碎化草地复壮问题提供一定的理论支持和实践应用技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样 于2016年10月在蒙辽交界阜新市彰武县章古台镇的辽宁省风沙土壤研究所内的4个采样点采集沙化土样，分别标记为SH1、SH2、SH3、SH4，将样品立即带回实验室，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0～7.2。

无机磷培养基：葡萄糖10 g、硫酸铵0.5 g、氯化钠0.3 g、氯化钾0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5 g、琼脂20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH值7.0～7.5[8]。

有机磷卵黄培养基：NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、蛋白胨 10.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0～7.5，临用时每50 mL溶液中加入新鲜蛋黄液3 mL（蛋黄液按无菌生理盐水与鸡蛋黄体积比为1 ∶ 1配制）。

1.1.3 药品 聚乙二醇6000（PEG6000）：将订购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的PEG6000配制为0、30、60、90、120、150、180、210 g/L的不同浓度梯度，干旱胁迫分为轻度胁迫（<10%）、中度胁迫（10%～20%）、重度胁迫（>20%）3个等级。

1.2 方法

1.2.1 沙化土壤微生物的分离筛选

1.2.1.1 沙化土壤微生物的分离纯化 称取4种土样各 10 g 分别放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，置于120 r/min摇床上振荡培养0.5 h，分别得到土壤悬液1、悬液2、悬液3、悬液4。将各土壤悬液分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4 g/mL。取已稀释的土壤悬液分别涂布于平板培养基上，25 ℃，培养3 d。采用连续划线法对菌株进行纯化，即挑取单菌落进行培养，最后将已纯化的菌株接种于斜面培养基上，于4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 微生物菌株的鉴定 （1）形态学观察。将已分离纯化的菌株涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃培养48 h，观察菌落;单染色制片，于光学显微镜下观察细胞个体形态。（2）生理生化鉴定。依据《伯杰细菌鉴定手册》第八版方法进行糖发酵、淀粉水解反应、明胶液化、柠檬酸盐试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P）、H2S试验、吲哚试验、接触酶试验、硝酸盐还原反应等生理生化指标。（3）分子生物学鉴定。提取细菌基因组DNA，利用27F、1492r正反引物进行16S rDNA序列PCR扩增，将测得的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST分析，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.2.2 2芽孢杆菌抗旱能力测定 母液制备：将2株芽孢杆菌分别接入牛肉膏液体培养基中，在28 ℃、120 r/min条件下培养24 h;将母液以5%的接种量接入含不同浓度的PEG液体培养基中，在28 ℃、120 r/min条件下培养2 d，于紫外分光光度计下测定D700 nm值，分析其抗旱能力。

1.2.3 2株芽孢桿菌解磷能力测定

1.2.3.1 磷标准曲线的绘制 精确称取经105 ℃烘干2 h的磷酸氢二钾0.439 0 g，用水溶解后，加入5 mL浓硫酸，然后加水定容至1 000 mL，该溶液含磷100 mg/L，将该溶液稀释为5 mg/L磷标准溶液。分别吸取 5 mg/L 磷标准溶液0、2、4、6、8、10 mL于50 mL容量瓶中，同时加入与显色测定所用的样品溶液等体积的空白溶液及二硝基酚指示剂2～3滴，并用10%碳酸钠溶液调节溶液至刚呈微黄色，准确加入钼锑抗显色剂5 mL，摇匀，加水定容，即得含磷量分别为0、0.2、04、0.6、0.8 mg/L的标准溶液系列，于25 ℃放置30 min后，在波长为700 nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制标准曲线[4]。

1.2.3.2 菌株发酵培养 将筛选出的菌株接入盛有牛肉膏液体培养基的摇瓶中，在28 ℃ 120 r/min条件下发酵培养 48 h，获得发酵液。

1.2.3.3 解无机磷能力测定 将发酵液以2%的接种量接入无机磷培养基中，装液量为30 mL/150 mL，对照组中接入同等体积的无菌水，每组4个平行，于28 ℃、120 r/min分别振荡培养1、2、3、5、7 d，然后采用钼锑抗比色法测定解磷含量[4]，并計算解磷率。

干旱胁迫下解无机磷的测定方法：将发酵液以相同方法接入含有浓度为150 g/L的PEG无机磷培养基中，以上述相同的方法对解磷含量进行测定，并计算解磷率。

解磷率=（培养后接菌培养液中PO43-含量-对照培养液中PO43-含量）/培养前未接菌培养液中PO43-含 量×100%[5]。

1.2.3.4 解有机磷能力测定 用无菌滤纸片蘸取10 μL菌株发酵液接种于有机磷卵黄平板培养基中心位置，每株菌设3个平行，对照组蘸取等量无菌水用同样方法接种，于28 ℃条件下，分别培养1、2、3、5、7 d，测定解磷圈直径D和菌落生长直径d，解磷率=D/d×100%。

干旱胁迫下解有机磷的测定方法：以上述相同方法将菌株发酵液接种于浓度为60 g/L的PEG有机磷卵黄平板中，于28 ℃条件下，分别培养1、2、3、5、7 d，测定解磷圈直径D和菌落生长直径d，解磷率=D/d×100%。

2 结果与分析

2.1 沙化土壤微生物的分离鉴定

从沙化土壤中分离得到76株细菌，将其中2株分别命名为STW-64、STW-2。

2.2 2株芽孢杆菌菌株的鉴定

2.2.1 2株细菌的形态学和生理生化鉴定 分别对菌落和菌体进行形态学观察，结果发现，STW-2菌落呈圆形，表面湿润光滑，菌落微黏，淡黄色，不透明;菌体革兰氏染色阳性，能运动，可产生内生孢子，杆状，长度约2 μm，直径约1 μm（图1）。STW-64菌落呈圆形，表面光滑，湿润，乳白色，不透明;菌体杆状，末端圆，单个或呈短链排列，1.2～1.5×2.0～4.0 μm，能运动，革兰氏染色呈阳性，具内生孢子（图2）。

分别对2株细菌进行生理生化鉴定，结果见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册》第八版，结合形态学观察及生理生化鉴定结果，确定STW-2、STW-64均为芽孢杆菌属，其中 STW-2 菌株是阿氏芽孢杆菌，STW-64菌株是巨大芽孢杆菌。

2.2.2 16S rDNA分子鉴定结果 菌株16S rDNA序列扩增和序列分析比对结果见表2，NCBI 数据库中与菌株相似度较高的菌株均属于Bacillus，属其中模式种Bacillus aryabhattai、Bacillus megaterium与菌株STW-2、STW-64的基因同源性相似度分别达到99%、100%（图3）。

形态学和分子生物学鉴定结果表明，STW-2菌株为阿氏芽孢杆菌，STW-64菌株为巨大芽孢杆菌。

2.3 2株芽孢杆菌菌株抗旱能力

从图4可以看出，2株芽孢杆菌菌株在干旱胁迫条件下，菌株悬液的吸光度随着PEG浓度的增加整体呈下降趋势，说明干旱胁迫对菌株生长有影响。随着PEG浓度的增加，菌体数量逐渐下降，至PEG浓度为210 g/L（重度胁迫）时，其2株菌株仍有一定的存活，表明其抗旱能力很强。

2.4 2株芽孢杆菌菌株解磷能力

2.4.1 2株芽孢杆菌降解无机磷能力 磷标准曲线见图5。

2.4.1.1 无胁迫条件下解无机磷能力 从图6可以看出，在以磷酸三钙为唯一磷源的培养基中，2株菌均有不同程度降解无机磷的能力，随着培养时间的增加，解磷含量也不断增加，通过钼蓝比色法测定得到，STW-2菌株在培养2 d时的解磷率达到9.04%， STW-64菌株在培养7 d时的解磷率达11.61%。

2.4.1.2 干旱胁迫条件下菌株解无机磷能力 从图7可以看出，2株菌在150 g/L PEG浓度胁迫下以磷酸三钙为唯一磷源的培养基中培养时，STW-2、STW-64菌株的解磷量均随着培养时间的延长逐渐升高，培养7 d时的解磷率分别达 5.03%、4.03%。

2.4.2 2株芽孢杆菌降解有机磷能力

2.4.2.1 无胁迫条件下降解有机磷能力 2株菌均有溶解有机磷能力，图8为培养4 d后拍摄的解磷平板，可以看出，2株菌解磷圈大小不同，初步判定解磷能力不同。从图9可以看出，STW-2菌株在培养4 d时达到最大解磷能力，解磷率值达到2.48%;STW-64菌株在培养1 d时解磷能力达到最大，对应解磷率为1.80%，随着时间的延长，2株菌的解磷能力逐渐下降，但STW-2菌株解磷能力高于STW-64菌株。

2.4.2.2 干旱胁迫条件下降解有机磷能力 干旱胁迫下2株菌溶解有机磷的能力均低于正常条件下，从图10可以看出，STW-2菌株在干旱胁迫条件下培养2 d时解磷能力达到最大，解磷率达1.42%;STW-64菌株在干旱胁迫条件下培养1 d时解磷率达1.96%，随着培养时间延长菌株解磷能力整体下降。但是干旱条件胁迫下STW-64菌株解磷能力整体高于STW-2菌株。

3 讨论与结论

通过无机磷、有机磷平板复筛解磷菌可能会漏掉一些溶磷菌，本研究发现，在无机磷固体培养基中几乎没有溶解无机磷能力的菌（数据未展示），通过液体发酵培养会表现出不同程度的溶磷能力，通过固体和液体2种方式培养菌株进一步研究其解磷能力更为合理。

本研究发现，解磷菌在干旱胁迫条件下解有机磷能力并不是随着培养时间的延长而逐渐增强，相反是在培养过程中某一天表现出较强的解磷能力，说明不能在培养特定时间时测定其解磷能力，这样可能会造成误差。

细菌解磷是一个漫长而又复杂的过程[9-10]，在解磷过程中，发酵液的pH值会变小，说明细菌在解磷过程中产生了酸性物质。酸性物质能与钙、铁、镁等金属形成络合反应，使磷酸盐溶解[11]。

本研究在实验室条件下筛选得到2株能够溶解无机磷和有机磷的菌，但是实验室中模拟的干旱胁迫条件与自然环境的沙化土壤条件还存在很大差异，因此，这2株菌作为菌肥是否能够在沙化土壤中发挥其重要作用，还有待在生产实践中进一步验证。

研究发现，2株菌有不同程度的解磷能力，无胁迫条件下，STW-64菌株在培养3 d的解无机磷能力较强，STW-2菌株解有机磷能力较强。STW-64菌株抗旱能力明显高于STW-2菌株。STW-2菌株在干旱胁迫条件下解无机磷的能力明显高于STW-64菌株，STW-64菌株在干旱胁迫条件下解有机磷能力整体高于STW-2菌株。

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