农杆菌介导的水稻快速高效基因转化系统

高璐　薛永来

摘要：农杆菌介导的水稻遗传转化体系被广泛应用于水稻功能基因研究、T-DNA插入突变体库创建和农艺性状改良等研究领域。然而水稻转基因操作需要超过3个月的组织培养时间。运用组织培养和农杆菌介导的遗传转化技术，对水稻遗传转化体系进行快速高效的优化。结果表明，成熟种子用2，4-D诱导愈伤7 d后，与农杆菌共培养转化效率最佳;抗性筛选时间以2～4周为最佳。根据以上优化条件，从成熟种子诱导愈伤至获得转基因株系的时间被缩短到6周左右。将有效降低水稻长时间组培导致的体细胞无性系变异概率，对促进水稻分子育种的发展有重要意义。

关键词：粳稻;农杆菌介导;遗传转化

中图分类号： S511.2+20.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0039-03

水稻高效遗传转化体系的建立是进行水稻功能基因分析、创建T-DNA插入突变体库和分子遗传改良的技术基础。然而一般来讲，在获得水稻转基因株系前，至少需要3个月以上的组织培养时间，这使得水稻的分子生物学相关研究周期远比其他物种漫长。另有文献报道，长时间的体外组织培养可能引起水稻愈伤组织的无性系变异，导致基因组改变[1]。因此建立高效快速的转化体系，不仅能够提高操作效率，还可以尽可能地减少细胞无性系变异，对水稻基因工程研究有重要意义[2-6]。

研究认为，水稻成熟种子诱导愈伤培养至少2～3周后，获得的愈伤组织才适用于农杆菌侵染[1，7-8]。但是Toki等曾报道农杆菌介导的高速的水稻转基因体系，认为在水稻愈伤培养1 d后即可进行侵染共培养试验[9]。但也有研究认为早期侵染并不能获得足够的阳性抗性愈伤，转化率低于10%[10]。本研究就水稻遗传转化体系中预培养以及抗性筛选阶段的条件进行摸索，在保证高效农杆菌转化率的同时，建立既高效又高速的水稻遗传转化体系。

1 材料与方法

试验于2015年12月至2016年10月在江苏大学环境与安全工程学院生物质能源研究所能源植物研究室进行。使用的水稻（Oryza sativa）品种为日本晴和南粳9108。

1.1 质粒构建

本研究使用的表达载体pBINPLUS为笔者所在实验室保存，在AscⅠ和PacⅠ酶切位点之间插入RbcS1启动子和终止子序列，构建成pBINR载体，将该载体使用冻融法导入农杆菌植株EHA105中[11]。

1.2 培养基

本试验所使用各种培养基均列于表1中。

1.3 植物材料与预培养

试验使用粳稻品种日本晴和南粳9108由江苏省农业科学院提供，其中南粳9108为江苏省内及周边地区广泛种植的推广品种。水稻种子剥去颖壳加1滴含吐温-20的5%次氯酸钠溶液浸泡消毒15 min，然后用无菌水清洗5遍。然后再用无吐温的次氯酸钠溶液消毒15 min，并用无菌水冲洗10遍左右，彻底去除次氯酸钠残留。用无菌滤纸吸干种子表面水分后，种子胚向上斜插到NBD培养基上，16 h光照/8 h黑暗，28 ℃培养。每皿放置20粒种子，每个处理设6个重复。

1.4 农杆菌侵染及转基因植物筛选

挑取含有pBINR载体的农杆菌单菌落于含有50 mg/L卡那霉素的AAM液体培养基中，28 ℃遮光200 r/min振荡培养至D600 nm为0.4～0.6，离心收集菌体并用液体NB-As重悬至D600nm=0.1。选取大小合适、状态良好的的愈伤组织，浸入农杆菌重悬液中30 min，在无菌滤纸上吸干多余菌液后，将愈伤组织转移到铺有1层无菌滤纸的固体NBD-As培养基上，暗培养3 d。将愈伤用无菌水清洗3遍，之后用含有 150 mg/L Timentin的無菌水浸泡10 min，将愈伤多余水分吸干，转移至NBD-As培养基恢复培养4 d。之后转移到含有筛选抗生素卡那霉素的NBD-TK培养基上继续筛选培养，每2周继代1次。有卡那霉素抗性的愈伤组织转移入分化培养基RE1中，催化的不定芽生长至3～5 cm小苗时，将小苗切割并转入生根培养基RE2中进行生根诱导，获得T0代幼苗。

1.5 转基因植物的分子鉴定

取T0代幼苗叶片0.1 g，采用TaKaRa植物基因组DNA小量纯化试剂盒（No. 9768）提取水稻总DNA。根据RbcS1启动子和终止子序列避开水稻同源序列，设计合成引物，序列为P1：5′-TTTAGGAGATACCAGCCAGG-3′;P2：5′-AACTTAGTAGCCATCGGGC-3′，PCR退火温度为55 ℃，循环次数为30次。经琼脂糖凝胶电泳检测，在 800 bp 左右有目的条带即为阳性。

2 结果与分析

2.1 预培养条件对水稻愈伤培养的影响

水稻胚诱导愈伤组织受到多方面因素的影响。本试验发现种子的状态和光照对水稻愈伤的生长有明显影响。优良的种子状态是愈伤生成的关键因素（表2）。在剥除颖壳的过程中根据形态等因素对种子进行初步筛选，对后期水稻愈伤组织的成功诱导有很重要的作用。另外，对比暗培养和光照培养的水稻愈伤发现，光照培养下的愈伤组织生长更快，呈浅黄色且较致密，更有利于缩短培养时间和分化诱导。

2.2 预培养时间对农杆菌侵染转化效率的影响

预培养时间对日本晴和南粳9108这2个品种的转化率有明显的影响。经过2～3次继代的愈伤转化效率最高，明显高于培养4周未继代直接侵染的愈伤组织。继代超过4次的2个品种的转化率均开始明显下降，同时分化能力也明显下降。说明长时间的诱导愈伤培养对水稻基因转化率和分化率都有影响。研究发现2个品种预培养4 d和7 d后直接进行农杆菌侵染，也能获得较高的转化率，其中预培养7 d后的基因转化率高达69.0%和61.7%，接近继代2～3次后水稻愈伤组织的转化效率（表3）。

2.3 篩选时间对分化效率的影响

水稻愈伤组织与农杆菌共培养后，被转入含有筛选抗生素的筛选培养基上，以筛选出成功将目的基因整合入植物基因组的阳性克隆。为提高农杆菌侵染效率，将农杆菌菌体收集并用 NB-As 培养基重新悬浮菌体至 D600 nm为0.1。 试验证明，较低的农杆菌密度不但能够提高转化效率（数据未显示），并且容易洗清，避免因农杆菌生长旺盛无法彻底去除而将愈伤组织包埋、影响愈伤组织生长的现象。

筛选培养的时间对愈伤组织分化效率也有影响。筛选时间太短，假阳性克隆太多，加大了后期分子生物学鉴定的工作量;筛选时间太长，不但拖延科研时间，还会出现因愈伤组织培养时间太长而导致分化能力下降的现象。如表4所示，筛选培养继代2次以内，水稻愈伤组织的分化效率在80%左右，随着继代次数的增加，分化效率有降低的趋势，且延长是整个体系的操作时间。

2.4 转基因水稻幼苗的PCR验证

将生根后的不定芽幼苗从培养基中取出，移栽到含有营养土的水桶中，在温室中栽培，即可继续生长直至收获。为进一步鉴定阳性植株中目的基因的存在，对T0代幼苗的叶片进行PCR鉴定。结果如图1所示，2个水稻品种的转化率没有差异，说明本体系对该2个品种均适用。同时筛选培养时间对水稻的植株转化率也没有明显影响（数据未显示）。

3 讨论与结论

水稻是我国重要的粮食作物，也是农业科学和植物学研究的重要模式植物。建立高效的水稻转化体系，是水稻功能基因研究、性状改良、抗性提高等科学研究的技术基础。自1994年Hiei等报道水稻转基因技术以来，国内外的科研工作者通过培养基改良、操作步骤优化等措施，不断改进优化水稻的基因转化体系，实现了水稻转化率的大幅提高[7，9-10，12-16]。近年来，无选择标记技术更是广泛应用于水稻新品系的培育[17-19]。试验材料是水稻农杆菌转化的重要基础。本研究采用成熟种子为试验材料，材料简单易得，经过初步的筛选，愈伤诱导率可以高达90%以上，预培养7 d作为转化的受体材料，转化率可达60%～70%，完全满足研究需要。本系统使用较高浓度的次氯酸钠和吐温-20对水稻种子进行2次消毒。该方法简单易行，在实际操作中污染率基本为零，而且同时还去除了种子表面各种油和蜡质，有利于农杆菌的顺利侵染[9]。光照在水稻种子萌发和愈伤生成中也有重要的作用，与暗培养相比较，长日照条件下培养的愈伤组织生长更快、结构更加紧密，这种愈伤有利于后期芽的分化[10，14，20-22]。

本研究主要针对水稻转基因体系中耗时较长的2个步骤（即愈伤组织预培养和抗性筛选过程）进行优化。过去的大量研究中，水稻在含有2，4-D的培养基上培养28 d以上，诱导出足够的愈伤组织用来转基因操作。Toki等曾报道，愈伤诱导1～5 d后用农杆菌侵染即可获得较高的转化率[9]。但是笔者多次试验并没有达到文献报道的高转化率。结合前期经验，对水稻转基因部分步骤进行摸索优化，最终发现，在含有2，4-D的培养基上培养7 d后，与农杆菌共培养，能获得可接受的高转化率，且结果稳定。同时较低浓度的农杆菌不仅能够获得更高的转化率，还避免了后期因农杆菌浓度过高引起的愈伤感染过度或农杆菌污染引起的愈伤褐化死亡[13，15，22]。在抗性筛选阶段，研究发现2周以上的抗性筛选过程即可有效地去除未整合目的基因的阴性愈伤，同时获得高效分化的阳性愈伤组织。以上结果与文献报道结果[13，15，20-23]相似，且得到后期分子生物学手段验证。通过以上2个步骤的优化，将水稻转基因操作体系缩短到6周以内，提高了工作效率，对于水稻的功能基因研究乃至分子遗传育种都有重要意义。

在农作物生理生化和分子遗传育种研究工作中，水稻转基因体系已经是必不可少的技术平台之一。本研究通过优化预培养和抗性筛选2个步骤，缩短了水稻转基因的操作周期，为提高科研效率提供了可能。同时，根据该项研究的结果，可对其他水稻品种以及禾本科其他植物的转化进行优化研究。本体系的扩大应用将有助于利用分子生物学手段对禾本科植物的功能基因组和农艺价值改良的深入研究。

参考文献：

[1]Labra M，Savini C，Bracale M，et al. Genomic changes in transgenic rice （Oryza sativa L.） plants produced by infecting calli with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports，2001，20（4）：325-330.

[2]吕 彦，王平荣，孙业盈，等. 农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程育种中的应用[J]. 分子植物育种，2005，3（4）：543-549.

[3]张 欣，付亚萍，周君莉，等. 水稻规模化转基因技术体系构建与应用[J]. 中国农业科学，2014，47（21）：4141-4154.

[4]Yamauchi T，Iida S.Gene targeting in crop species with effective selection systems[M]. Double-strand break repair and its application to genome engineering in plants. New York：Springer，2015：91-111.

[5]颜文飞，张启军，秦海龙，等. 运用农杆菌介导的针刺法将外源基因转入水稻[J]. 江苏农业学报，2015，31（4）：718-724.

[6]张喜娟，来永才，孟 英，等. 粳稻转基因技术体系的研究与应用进展[J]. 黑龙江农业科学，2017（4）：136-139.

[7]Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. The Plant Journal，1994，6（2）：271-282.

[8]Hiei Y K T，Kubo T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Molecular Biology，1997，35（1/2）：205-218.

[9]Toki S，Hara N，Ono K，et al. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice[J]. The Plant Journal，2006，47（6）：969-976.

[10]陈 惠，赵 原，种 康. 一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统[J]. 植物学通报，2008，25（3）：322-331.

[11]Holsters M，de Waele D，Depicker A，et al. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular & General Genetics，1978，163（2）：181-187.

[12]Komari T，Hiei Y，Ishida Y，et al. Advances in cereal gene transfer[J]. Current Opinion in Plant Biology，1998，1（2）：161-165.

[13]牟 晨，金 菁，石金磊. 根瘤农杆菌介导的水稻转基因方法的

优化研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（7）：3867，3880.

[14]王北艳，向殿军，殷奎德. 提高粳稻成熟胚抗性愈伤再生频率的研究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（1）：28-31.

[15]周 艳，黄亚萍，周 遥，等. 农杆菌介导的遗传转化籼稻Kasalath的条件优化[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2013，39（5）：471-477.

[16]易自力，曹守云，王 力，等. 提高农杆菌转化水稻频率的研究[J]. 遗传学报，2001，28（4）：352-358.

[17]段忠卫，李希臣，张 军，等. 无选择标记转高赖氨酸蛋白基因水稻植株的培育[J]. 东北农业大学学报，2013，44（7）：46-51.

[18]冯梦诗，叶 俊，侯莉莉，等. 無选择标记基因的优质香稻新品系培育[J]. 华北农学报，2015，30（5）：92-96.

[19]Mejima M，Kashima K，Kuroda M，et al. Determination of genomic location and structure of the transgenes in marker-free rice-based cholera vaccine by using whole genome resequencing approach[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120（1）：35-48.

[20]王春萍，谢树章，蒋晓英，等. 农杆菌介导的籼稻科恢675快速遗传转化体系的建立[J]. 西南农业学报，2012，25（1）：1-5.

[21]李素娟，樊秀霞，王 华，等. 水稻不同品种组培再生和转基因频率研究[J]. 核农学报，2013，27（12）：1817-1827.

[22]张燕红，赵志强，吴泽新，等. 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系的研究[J]. 新疆农业科学，2014，51（8）：1457-1462.

[23]周 蕾，陈 晨. 农杆菌介导水稻遗传转化方法的优化研究[J]. 农业与技术，2015，35（17）：33-34，37.仵 陶，安胜军，邵铁梅，等. 微型人胰岛素基因载体的构建及其在花生中的表达[J]. 江苏农业科学，2019，47（4）：42-46.