植物单宁细胞研究进展

黄海娜　程大伟　顾红　张洋　郭西智　陈锦永

摘要：单宁细胞普遍存在于植物的各个部位，具有保护植物免受逆境伤害的功能，其内含物主要成分（单宁）在制革、医药、食品、材料及化工等领域具有重要的应用价值，已成为近年来国内外的研究热点。笔者综合国内外研究报道，就单宁细胞的基本特征、观察方法及影响其形成的因素展开论述，阐述了其与果实涩味及果实脱涩的关系，并对今后单宁的研究方向进行了展望，旨在为单宁细胞的研究提供有价值的依据。

关键词：单宁细胞;基本特征;果实涩味;观察方法

中图分类号： S184  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0029-05

单宁，又名单宁酸、鞣酸，广泛存在于植物的根、茎、叶、果实及树皮等部位，是相对分子质量为500～3 000 u的多酚化合物[1]。根据单宁的溶解性，可将其分为可溶性单宁和不溶性单宁[2]，其中可溶性单宁被认为是引起涩味的主要物质，其与人体口腔黏膜蛋白结合产生强烈的收敛性，引起“涩感”[3]。单宁类物质并不是所有植物细胞都含有，而是存在于一种特殊细胞中，这种特殊细胞被称为单宁细胞[4]。当咬破果实时，单宁细胞破裂，可溶性单宁流出，与唾液蛋白结合，使人感到强烈的涩味。单宁具有抗氧化、抑菌等生理活性，在制革、化妆品、食品工业、医药等方面有很高的应用价值[5]。因此，前人多注重于植物单宁的提取、抗氧化能力、含量变化以及与涩味的关系等方面的研究[6-9]，而对单宁细胞的研究缺少系统报道。笔者综合国内外研究报道，就单宁细胞的观察方法、基本特征及与果实涩味的关系展开论述，以期为单宁细胞研究者提供一些有价值的参考。

1 单宁细胞的基本特征

单宁细胞在大小、体积、形态及分布上均表现出多样性，不仅在树种间和品种间有所不同，而且同一果实内不同部位的单宁细胞也存在差异，并且随着果实的发育发生着相应的变化。

1.1 单宁细胞的大小和密度

不同植物或同一植物不同部位的单宁细胞大小和密度均不相同。单宁细胞存在于所有植物中，但至今对柿果实的单宁细胞研究最为透彻，张宝善等研究发现，成熟期的柿果实单宁细胞要比幼果期的大3倍左右，在果实生长发育过程中，涩柿单宁细胞的体积和密度随果实生长逐渐增大，且均大于甜柿，在果实发育后期，甜柿单宁细胞呈现停滞生长状态，而涩柿单宁细胞持续生长直至成熟[10]。费学谦等研究发现，成熟期涩柿单宁细胞面积占果肉总面积的11%以上，而甜柿单宁细胞仅占3%左右[11]。杨勇等研究发现，单宁细胞的纵横径随果实生长逐渐增大，其中纵径增大显著，横径增大缓慢，完全甜柿的单宁细胞纵横径在同期均比完全涩柿小[12]。章镇等研究发现，果实成熟后期完全涩柿单宁细胞的大小和密度较完全甜柿大;柿果实心室间和心室内外的单宁细胞密度均不同，且不同类型柿品种之间存在着较大的差异[13]。夏宏义研究发现，不同柿品种间单宁细胞纵横径差异显著，完全涩柿的单宁细胞纵横径较大，中国甜柿和日本完全甜柿均较小，不完全甜柿和不完全涩柿与部分完全涩柿相近[14]。张继澍等对果实发育中期的41个柿品种的单宁细胞进行观察发现，一般情况下，涩柿单宁细胞的密度大于甜柿，但并不是所有涩柿品种的单宁细胞密度均大于甜柿，有些涩柿品种如作州身不知、巴柿、东洋一等单宁细胞密度较小，而甜柿如水岛御所、伊豆、大河御所等密度则较大[15]。同一果实不同部位的单宁细胞大小和密度也不相同，大多数柿品种果实中部的单宁细胞密度最大，其次是基部，顶部最小;一般从果实顶部到基部，单宁细胞纵径由小到大，而横径变化不明显。

1.2 单宁细胞的形态和分布

单宁细胞的形态结构非常复杂，其在表面特征、褐变程度、形状、内含物的质地及质壁分离上均表现出多样性[16]。杨勇根据单宁细胞不同的分类依据进行了相应描述，如依表面特征分为棘刺状、瘤状、凹陷状及自然平滑状;依褐变程度分为红褐变、深褐变、淡褐变、未褐变;依据几何形状分为细长形、长形、椭圆形、近圆形、多角形、尖头形;依质地类型分为碎裂型、易流型、固有型;依质壁分离程度分为极分离、稍分离、不分离等[17]。而且單宁细胞主要以单细胞形式存在，几种不同形状的单宁细胞可同时存在于同一果实中，有些则以单宁细胞束或细胞团的形式存在。单宁细胞的形态结构在脱涩过程中也会发生相应变化，陈文军等研究发现，正常柿果肉中单宁细胞呈可溶性絮液状，半脱涩的单宁细胞呈粒浆状，而完全脱涩的成熟果实中的单宁细胞呈颗粒状，果实复涩后单宁细胞又由粒块状变成粒块絮液状[18]。张宝善等研究表明，不同脱涩方法对柿单宁细胞的影响基本相同，均是使单宁细胞体积缩小，最后变成疏散的小颗粒;返涩后单宁细胞中的单宁溢出，呈网状结构分散于果肉组织中[10]。

水果的单宁细胞主要存在于果皮中，但不同水果的单宁细胞分布并不完全相同，研究发现，葡萄[19]、香蕉[20]及石榴[21]等果实的单宁细胞主要分布在外果皮中;而柿果实的单宁细胞主要存在于中果皮内，外果皮仅有少量分布，内果皮不存在单宁细胞[12]。章志远等研究发现，麻竹笋笋体单宁主要分布于薄壁细胞内，少量在纤维细胞内，维管束中的筛管和导管细胞中无单宁存在[22]。单宁细胞大量存在于树皮中，史敏晶等对巴西橡胶树树皮单宁细胞的研究表明，除伴胞外，次生韧皮部中几乎所有的薄壁细胞都含有单宁类物质，乳管周围的薄壁细胞中尤易积累单宁，石细胞和周皮中的木栓层以及栓内层细胞中也有大量单宁积累，在单宁细胞发育过程中，单宁首先在细胞质中产生，中央大液泡形成后则成为积累单宁的主要场所并最终被单宁类物质充满[23]。吴钿等研究发现，5种红树科植物叶片的表皮和下皮层的细胞常含有单宁类物质[24]。

1.3 单宁细胞的内含物及功能

Taira等研究发现，单宁细胞的内含物主要以总酚类物质为主，其中单宁类物质所占比例最大[25-26]。在柿单宁组分中，主要以缩合单宁为主，占总酚含量的70%～75%，而游离的小分子单宁组分较少[27]。夏宏义等研究表明，成熟柿果肉单位质量总酚和缩合单宁含量与单宁细胞总体积占果肉组织的比例呈正相关关系，且完全涩柿的总酚含量和缩合单宁含量大于完全甜柿，进一步证明缩合单宁是单宁细胞的主要组分[28-29]。缩合单宁是由黄烷-3-醇类单体聚合而成，单体之间均以C—C键相连，分子结构比较稳定，在水溶液中不易水解[30]。缩合单宁的聚合程度与果实涩味程度有直接联系，在一定范围内，果实涩味随缩合单宁聚合度的增大而增强[31]。

单宁细胞的形成是植物在不利条件下快速作出的防御反应，具有保护植物免受生物和非生物危害的防御功能，在抵御恶劣环境和生物侵害中起重要作用[32]。另外，单宁细胞的内含物（单宁）具有保护植物，抗水解、抗腐烂和防止动物危害的作用[33]，还具有结构类型多样性和生物活性广谱性[34]等特点，在制革、医药、食品、材料及化工等多学科领域得到广泛的应用[35-39]，具有不可估量的开发利用价值。

1.4 单宁细胞与果肉细胞的区别

单宁细胞与果肉细胞不论是否染色在形态上均有所不同，Yang等研究发现，成熟柿果实的果肉用氯化亚铁和硫酸亚铁处理后，单宁细胞呈黑色，果肉细胞无色;用盐基品红染色后，单宁细胞呈深红色，果肉细胞呈淡红色;结晶紫染色后，单宁细胞呈深紫色，果肉细胞呈血青色;亮绿可将单宁细胞染成绿色，而果肉细胞呈淡绿色[16]。章志远等研究发现，麻竹笋的单宁细胞可被2%氯化亚铁溶液染成黑色，与不含单宁物质的细胞区别明显[22]。王慧等研究发现，翠冠梨的单宁细胞被番红-固绿染成暗红色，而果肉细胞被染成淡绿色[40]。杨勇在观察过程中还发现，由于单宁细胞与果肉细胞内含物不同，折光率也有差异，单宁细胞色深，果肉细胞近于透明[16]。Yonemori等对柿的研究发现，平核无和宫崎无核2个品种的单宁细胞中含10%～12%的单宁和10%～13%的可溶性糖，而果肉细胞中仅含微量的单宁和20%左右的可溶性糖，二者内含物含量差异十分显著[41]。

2 单宁细胞与果实涩味及果实脱涩的关系

单宁细胞的结构和密度与果实涩味及果实脱涩关系密切。Yonemori等对日本完全甜柿、不完全甜柿、完全涩柿及不完全涩柿的4个品种进行观察发现，在果实发育早期，这4个品种的单宁细胞均有细胞壁孔，果实很涩;在果实发育后期，完全甜柿和不完全甜柿的单宁细胞的细胞壁孔消失，果实脱涩，而完全涩柿和不完全涩柿的单宁细胞结构和涩味变化不明显;对完全涩柿和不完全涩柿进行乙醇脱涩后发现，单宁细胞的细胞壁孔闭合，因而认为果实脱涩与单宁细胞的结构有关[42]。Yonemori等还观察到，在果实发育早期，甜柿和涩柿果实的单宁细胞密度大且紧密相连;在果实发育中后期，甜柿的单宁细胞分离并散布于果肉中，而涩柿则仍紧密相连且分布密集，因而认为单宁细胞的稀释作用是完全甜柿自然脱涩的主要原因[43-44]。Gottreich研究发现，未完全成熟的涩柿细胞壁凹陷大而多，细胞壁厚度约减小50%，未完全成熟的甜柿细胞壁凹陷小而少，厚度增加，而当果实成熟后，2种类型的柿单宁细胞壁的凹陷程度均有所改变，说明果实涩味与单宁细胞壁的厚度成反比关系[45]。费学谦等研究发现，中国完全甜柿的自然脱涩机理与日本完全甜柿不完全相同，其单宁细胞停止发育时间晚于日本完全甜柿，且单宁细胞停止发育时，可溶性单宁继续积累[11，46]，由此认为中国完全甜柿的脱涩是由单宁细胞的稀释和可溶性单宁凝固的双重作用的结果。

不同水果單宁细胞的形态、结构、理化性质等不同，其脱涩方式也不同。陈道明研究发现，不完全涩柿类和完全涩柿类在果实成熟期不能完全自然脱涩，必须经过人工脱涩处理才能达到可食用的标准[47]，一般以可溶性单宁含量0.2%作为果实是否脱涩的临界值[25]。柿果实的人工脱涩方法主要包括CO2脱涩、乙醇脱涩、真空包装脱涩、温水脱涩、软化脱涩及冻融脱涩等[48-49]。石榴汁的脱涩方法为明胶脱涩法，即在100 mL石榴汁中加入12 mL明胶、常温（10 ℃）下搅拌反应40 min、0.45 μm微孔滤膜过滤、100 ℃杀菌30 min，可有效去除石榴汁的涩味[50]。葡萄果实可通过使用植物生长调节剂降低涩味，霍珊珊等研究发现，在葡萄果实转色期前7 d，用100 mg/L ABA、200 mg/L ABA和400 mg/L GA3喷施果穗均能使果实成熟过程中的单宁含量显著降低[51]，使果实涩味减弱。不同脱涩方法的脱涩机理也不同，其中CO2、乙醇、真空包装和温水脱涩的脱涩机理相同：创造厌氧条件，激活乙醇脱氢酶，产生大量乙醛，然后在乙醛作用下促使单宁细胞内的可溶性单宁聚合为不溶性单宁[52-54]，使涩味消失;软化脱涩与冻融脱涩机理相似，在脱涩过程中单宁细胞受损，释放出的可溶性单宁与果胶、细胞壁或原生质膜的碎片结合形成不溶性单宁[55-56]，使涩味消失;明胶脱涩机理是单宁与明胶相互作用形成明胶-单宁络合物沉淀，使果汁涩味消失[57];植物生长调节剂是通过促进与单宁呈竞争关系的物质的合成使单宁合成受阻，从而降低果实涩味[58]。

3 单宁细胞的观察方法

3.1 组织切片法

组织切片法一般采用光镜石蜡切片法[10]和电镜超薄切片法[23]，观察单宁细胞的形态结构和大小，适用于植物各个部位中单宁细胞的观察。在研究初期，国内外研究者多采用组织切片法[13，59-60]观察单宁细胞的分布密度，以其分布密度来代表单宁细胞的多少作为单宁细胞研究的一项重要指标。切片法具有易观察、易保存、便于比较等优点，但仅适用于发育前期的果实，因为发育后期和成熟期果实的单宁细胞排列不规则，且不在同一平面，切片法易将单宁细胞纵切、横切、斜切，单宁细胞被切开后，内含酚类物质外流，影响对单宁细胞的观察，再者，在制片过程中的一些固定剂和乙醇会对单宁细胞产生影响，引起细胞收缩，因此，采用此法观察的单宁细胞形态和数目无法完全代表单宁细胞的特征，观察效果降低。

3.2 果肉压涂法

果肉压涂法主要应用于柿上，其操作步骤较切片法简便，直接将果肉放于载玻片上，滴加1滴蒸馏水，盖上盖玻片，轻轻敲打盖玻片，使果肉组织分散均匀，然后在光镜下观察测定相关指标[12]。果肉压涂法能够清晰地观察到单宁细胞和果肉细胞的结构，不仅细胞分散度高，并且加入适量水后，单宁细胞可在显微镜视野下滚动，能全面看清单宁细胞三维立体的外形特征，并能正确测定其纵横径长度，从而能够克服切片法仅观察到单宁细胞纵切面或横切面形状、对单宁细胞形态描述不全面的缺点。虽然切片法在观察果实中单宁细胞所占密度时有一定优势，但在对单宁细胞形态、大小的描述方面，软柿果肉压涂法较切片法具有简便易行、全面准确的优点。

3.3 果肉过滤澄清法

杨勇采用果肉过滤澄清法，将柿果肉在不锈钢筛网中压涂过滤至一个装清水的容器中，反复漂洗几次洗去果肉和杂质，即可得到完整洁净的单宁细胞，然后用吸管吸取单宁细胞置于载玻片上，在光镜下观察测定相关指标[17]。该方法能够清楚地观察到完整的单宁细胞形态，准确测定单宁细胞的纵横径长度，但无法准确测定单宁细胞的密度。

3.4 细胞倾析法

张青林等参考Ikegame等的方法，于柿果的赤道部切取标本块，迅速放入含0.2%单宁酸和2.5%戊二醛的混合溶液中固定12 h，用水冲洗后，又把样品浸入pH值为10的 0.05 mol/L EDTA的溶液中，在45 ℃、90 r/min的条件下振荡5 h，单宁细胞经过多次倾析与软组织细胞分离，用滴管吸取1滴单宁细胞放到载玻片上，用万能荧光显微镜观察。通过IPP5.0统计软件测定单宁细胞的面积和大小，此方法克服了传统压片法和切片法的弊端，可以观察果实任何时期的单宁细胞，为单宁细胞形态与生长变化规律的研究提供了新的思路[61-62]。

4 单宁细胞形成的影响因素

单宁是植物在进化过程中产生的一类次生代谢物质，对植物所处的特殊环境具有自身保护作用，其含量和单宁细胞的形成与植物生长环境的非生物因素和生物因素密切相关[63]。

4.1 非生物因素

植物生长的自然环境对单宁含量和单宁细胞的形成具有重要影响。Kapos等研究发现，在强酸、贫瘠的土壤条件下，植物体内及其枯枝落叶常含有很高的单宁类物质[64]。Kubota等研究发现，土壤干燥度影响桃果实的涩味程度，在桃果实发育的第3个阶段，土壤水分张力在pF2以上则与果实涩味的出现密切相关[65]。罗美娟等研究发现，木麻黄小枝单宁含量与离海岸带的距离呈负相关关系，这是因为离海岸带距离越近，环境越恶劣，风沙危害越严重，木麻黄通过产生更多的单宁类物质适应更恶劣的环境[66]。常朝阳等研究发现，分布于高原荒漠的锦鸡儿属植物较分布于森林和草原的叶片具有更明显的皮下层，主脉纤维更发达（5～7层），单宁类物质含量更高，表明植物会通过改变自身结构和单宁含量适应生态环境[67]。

4.2 生物因素

生物刺激对植物单宁含量和单宁细胞的形成也具有较大影响。史敏晶等研究证明，巴西橡胶树受到机械伤害和植物生长调节剂（乙烯利和茉莉酸）刺激时产生大量单宁细胞，其中乙烯利对单宁细胞的诱导效果最显著[23，68]。曹明兰对黄瓜的研究也证实，不同浓度的乙烯利浸种处理后的单宁含量较对照均有不同程度的提高[69]。张燕等研究发现，不同浓度的植物生长调节剂（水杨酸和乙烯利）处理葡萄果实，其单宁含量均有不同程度的提高[70]。雒珺瑜等研究发现，棉花对害虫（绿盲蝽）的抵抗能力与单宁含量呈正相关关系[71]。说明机械伤害、植物生长调节剂刺激及害虫侵害等与植物单宁细胞的形成密切相关。

5 展望

植物单宁细胞的研究越来越受科研领域的关注。国内外学者通过对植物单宁细胞解剖学的大量研究阐明了单宁细胞的基本特征及其与果实脱涩的关系。然而，目前对植物单宁细胞的研究仍存在一些有待解决的问题，应加强以下方面的研究：（1）单宁细胞观察方法方面。目前单宁细胞的观察方法主要包括切片法、果肉压涂法、果肉过滤法及倾析法等，其中切片法可以应用于植物任何部位单宁细胞的观察，但其具有易切碎细胞和引起细胞收缩等缺点，影响对单宁细胞完整结构的观察;而果肉压涂法、果肉过滤法及倾析法主要针对于果肉，且局限于柿果实单宁细胞的研究上，缺乏对其他植物种类相应技术的研究。因此，有必要开展对其他植物单宁细胞的观察方法的研究，以期为植物单宁细胞的研究提供进一步的技术支持。（2）单宁细胞的内含物方面。植物单宁细胞的内含物主要包括单宁类物质，单宁的前期合成包括苯丙烷类代谢途径和类黄酮代谢途径，但其后期合成途徑至今尚未研究清楚，应利用分子生物学手段加强对单宁物质合成途径的研究，完善单宁细胞形成机制。（3）单宁细胞与果实涩味关系方面。单宁细胞的结构、大小、密度及内含物含量与果实涩味密切相关，但目前对果实单宁细胞与果实涩味关系的研究局限于对柿果实的研究，应在此基础上开展其他水果的研究。（4）开展不同果实脱涩技术的研究，满足更广泛的植物果实降涩需求，提高果实品质。

参考文献：

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