稻虾共作对稻田土壤反硝化细菌nosZ基因数量、多样性及群落结构的影响

王蓉　龚世飞　金涛　刘章勇

摘要：对稻虾共作模式下水稻土壤反硝化细菌群落进行研究，以期揭示稻虾复合种养模式下土壤反硝化细菌丰度、群落多样性及组成，为科学研究稻虾共作模式的土壤微生物多样性，维持土壤地力提供理论依据。依托长江大学农学院基地设置常规中稻种植模式（MR）、稻虾共作模式（CR）等2种模式，利用荧光定量PCR和高通量测序平台比较2种模式下水稻土壤反硝化细菌nosZ基因的数量、群落多样性及群落组成。结果表明，稻虾共作显著提高水稻土壤硝态氮、全碳、全氮含量，对碱解氮含量、pH值、碳氮比及铵态氮含量无显著影响。nosZ基因在MR、CR处理中的基因丰度分别为1 g干土1.51×106、2.23×106拷贝数，CR处理中nosZ基因丰度是MR的1.48倍。CR处理显著提高了土壤nosZ基因的丰度。通过对α群落多样性指数进行方差分析可知，CR处理与MR处理间微生物群落多样性差异不显著。经韦恩（Venn）分析，在目和科水平上，MR處理与CR处理的微生物群落组成显示出较高的相似度，在属与种水平上，2个处理下的土壤微生物群落结构存在差异性，CR处理下的土壤缺失沼泽红假单胞菌。经冗余分析，土壤总碳（TC）含量对nosZ基因群落结构的影响最为显著，其次是pH值、碱解氮含量、硝态氮含量与铵态氮含量。综合分析，稻虾共作可显著提高水稻土壤nosZ基因丰度，稻虾轮作对群落多样性的影响较小，其在种水平上缺失了沼泽红假单胞菌。常规中稻种植模式与稻虾共作模式下的土壤微生物群落结构虽保有一定的相似度，但仍存在差异，土壤总碳含量是影响群落结构差异的主要原因。

关键词：稻虾共作;反硝化作用;荧光定量;高通量测序技术;α群落多样性;nosZ基因

中图分类号： S154.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0246-06

反硝化作用作为土壤氮循环的组成部分，在土壤氮素转化中占据重要地位[1-2]。反硝化过程在厌氧的条件下由微生物驱动，可产生氧化亚氮（N2O），被认为是土壤释放N2O的主要过程[3-7]，主要指硝化作用产生的硝酸根（NO3-）最终被还原成氮气（N2）的过程，中间过程会产生一氧化碳（NO）和N2O等气体，造成氮素损失，并引起一系列环境问题[8-10]。反硝化过程分为4个部分[11]：第1步在由nar或narp基因编码的硝酸盐还原酶的催化作用下，将硝酸盐（NO3-）还原成亚硝酸盐（NO2-）;第2步反应是在由nirK基因或nirS基因编码的亚硝酸盐还原酶的催化作用下，将亚硝酸盐还原成NO;第3步反应在由norB基因编码的一氧化氮还原酶的催化作用下，将NO还原为N2O，此步可将氮素以气态的形式排放;第4步是在由nosZ基因编码的氧化亚氮还原酶的催化作用下，将N2O还原为N2。由于氧化亚氮还原酶是控制N2O排放的主要调节因子，是完全脱氮途径最后一步的重要催化剂，因此nosZ基因通常被用作研究反硝化群落的遗传标记。稻田是重要的农业用地，其中约70%位于亚热带和热带地区，同时也是N2O的主要来源[12]。与旱地土壤不同，常年淹水的稻田土壤提供的厌氧条件有利于反硝化作用的发生[13]。稻虾种养是将水稻种植与克氏螯虾养殖相结合组成的互利共生复合生态农业系统，是稻田综合种养模式之一。该模式实现了一水两用、一田双收，在节约稻田水土资源的同时带来可观的经济效益[14]。当前，我国农业正面临着资源与环境约束加剧和农民增收难度加大的难题，稻虾生态种养高效模式的兴起，被农业部誉为“现代农业的一次革命”，很快在长江中下游地区获得大面积的推广种植。截至2016年，稻虾种养模式在江汉平原推广面积已经达到20万hm2以上[15]。统计显示，全国适合稻虾种养模式的稻田面积高达450万hm2[16]。稻虾种养模式面积逐年扩大，但国内外关于稻虾种养模式下参与稻田土壤反硝化反应微生物的研究较少。通过研究微生物种群数量和群落结构，可以明确稻虾土壤反硝化过程的作用机制及影响因素。本试验以江汉平原典型稻虾种养区湖北省荆州市为研究对象，研究该模式下土壤反硝化微生物的变化特征，以期揭示稻虾种养模式土壤微生物群落结构和多样性的变化规律，丰富稻虾种养模式反硝化微生物理论，同时为该地区土地利用改良、农业结构战略性调整以及发展稻虾种养高产高效生态友好型农业提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验地位于湖北省荆州市长江大学农学院基地（地理位置30°6′ N，111°54′ E）。该地区处于江汉平原地带，具有四季分明、雨热同季、年降水量充沛等特点，冬季受极地大陆气团影响，气温偏低，降水量少;夏季受热带海洋气团影响，高温多雨，水分季节分配不均，属于亚热带季风气候区，年均降水量在1 100 mm左右，无霜期200 d。土壤类型为潮土，土壤母质为河流冲积物。供试土壤全氮、全磷、速效钾含量分别为0.75 g/kg、0.54 g/kg、17.09 mg/kg，有机质含量为38.8 g/kg，pH值为7.5。

试验设置常规中稻种植模式（MR）与稻虾共作模式（CR），本研究自2015年开始，连续开展2年，于中稻抽穗期采集土壤样品作为研究对象。试验小区由长12 m、宽5 m的田埂围成，每个处理3次重复，为防止小龙虾逃出，田埂加高加固并在田埂周围铺设塑料膜。水稻品种为隆两优华占，小龙虾品种为克氏原鳌虾，施肥量采用当地习惯用量，年均施肥量为氮肥180 kg/hm2、磷肥75 kg/hm2、钾肥105 kg/hm2，以尿素（含N 46%）、过磷酸钙（含P2O5 12%）、氯化钾（含K2O 60%）的形式施用。氮肥按基肥：蘖肥：穗肥=5 ∶ 2 ∶ 3施用，磷肥用作底肥1次基施，钾肥按照50%基肥、50%追肥的方式施肥。2种模式水稻期间田间水分管理为前期灌水、中期晒田、后期干湿交替的模式。虾田于每年水稻收获后覆水泡田，随即投放虾苗，投放密度约为20万只/hm2，来年4月至6月上旬捕捞成虾，捕捞完成后开始整体准备中稻的移栽，等待水稻收获后进行下一轮的小龙虾养殖。

1.2 土壤样品采集

土壤样品在水稻抽穗期采集，用于基本理化性质分析与土壤微生物测定。采用不锈钢土钻按照5点采样法采集用于测定土壤基本理化性质的土样，重复3次，将土样带回实验室剔除石子、根系等杂物，存放在阴凉处混匀风干，待土样风干磨碎后分别过20目与100目筛用于室内分析。用谷物采样器采集用于测定水稻土壤微生物的样品，每个处理重复3次，样品采集后剔除石子与根系，然后立即放入锡箔纸中包裹，存放在液氮罐中，并带回实验室存放于-80 ℃冰箱备用。

1.3 土壤基本理化性质测定

土壤基本理化性质分析参考鲍士旦的方法[17]。土壤全氮、全碳含量采用ECS4024元素分析仪（意大利Costech公司）测定;土壤碱解氮含量测定采用碱解扩散法;土壤硝态氮含量采用 2 mol/L KCl溶液浸提并在203、270 nm下测定;铵态氮含量测定采用靛酚蓝比色法;pH值测定采用电位法（水与土质量比为2.5 ∶ 1）。

1.4 土壤总DNA提取

取0.25 g低温保存的土壤样品，用PowerSoil DNA Isolation Kit（美国Mobio公司） DNA试剂盒提取土壤总DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA，并用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）检测提取的DNA浓度与纯度。

1.5 反硝化微生物nosZ基因扩增与荧光定量PCR分析

用引物对[18]nosZF（CGYTGTTCMTCGACAGCCAG）和nosZ-1622R（CGSACCTTSTTGCCSTYGCG）扩增nosZ基因。PCR反应体系总体积为20 μL，包括：10 μL 2×syberMIX，0.2 μL 的2種上、下游引物（10 μmol/L），1 μL稀释8倍后的样品，最后用无RNA酶的ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸55 s，32个循环;72 ℃终延伸10 min，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

标准曲线的制备：将PCR产物纯化回收后，选取荧光假单胞菌的nosZ基因阳性克隆转接过夜培养，质粒浓度经分光光度计测定后，按照10倍梯度逐渐将质粒稀释至103～108拷贝数，-80 ℃低温保存。

荧光定量PCR反应在ABI7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）上进行，引物序列前文已标出，反应体系总体积为25 μL，包括2×SYBER Green 12.5 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O补至 25 μL，试验试剂购宝生物工程（大连）有限公司。

1.6 高通量测序

扩增产物经切胶纯化后连接至pUC-T载体上，转至大肠杆菌DH5α中进行培养，选用阳性克隆进行测序，序列提交至NCBI数据库进行比对，并将同源性大于等于97%的序列进行可操作分类单元（operational taxonomic units，简称OTU）聚类。

1.7 数据处理与作图

利用SPSS 22.0对土壤基本理化性质数据进行方差分析;采用CANOCO 5.0软件对土壤基本理化性质与反硝化微生物nosZ基因群落结构进行冗余分析（redundancy analysis，简称RDA），使用Mothur1.30.1在同源性达97%上进行群落多样性指数分析，nosZ基因数量采用Excel软件作图，R语言绘制曲线与相关热图。

2 结果与分析

2.1 不同处理下土壤基本理化性质

稻虾共作处理显著影响了部分土壤基本理化性质（表1）。方差分析结果表明，除土壤碱解氮含量、pH值、铵态氮含量及碳氮比（C/N）无显著变化外，稻虾共作显著增加了土壤硝态氮、全碳、全氮的含量。相比常规中稻种植模式，硝态氮含量提升了29.03%，全碳含量增加了2.37%，全氮含量提升了4.30%，对土壤pH值、碱解氮含量、铵态氮含量及C/N无显著影响。

2.2 测序结果及多样性指数

采用Miseq技术对微生物nosZ基因进行测序分析，数据经过优化筛选后，6个样品共测得原始序列218 108条，序列平均长度为407.74 bp，共测得碱基88 937 543个， 所有样品的序列长度在218～552 bp之间（表2）。按97%的相似度对非重复序列进行OTU分析，共得到344个OTUs。对各样本序列采用随机抽样方法进行抽样，以抽到的序列数与它们对应的物种多样性指数，构建稀释曲线。由图1可知，样本覆盖度（coverage）指数为0.998 2～0.999 2，稀释性曲线均趋于平坦饱和，表明此测序深度获得的序列数据量可以反映土壤样品nosZ基因微生物信息。

对α多样性指数进行单因素方差分析，结果（表3）显示，2个处理间多样性指数差异不显著（P<0.05）。MR处理的Ace指数、Chao指数、香浓（Shannon）指数、Sobs指数均高于CR处理，差异不显著;MR处理的辛普森（Simpson）指数低于CR处理，差异不显著。多样性分析结果表明，稻虾种养模式（CR）没有显著改变nosZ基因微生物群落丰富度及群落多样性。

2.3 稻虾种养对土壤nosZ基因丰度的影响

利用荧光定量技术对氧化亚氮还原酶nosZ基因进行定量分析，结果（图2）表明，CR处理nosZ基因丰度显著高于MR处理。其中CR处理中nosZ基因丰度为1 g干土2.23×106拷贝数，MR处理中nosZ基因丰度为1 g干土1.51×106拷贝数，CR处理nosZ基因丰度是MR处理基因丰度的1.48倍。与常规中稻种植模式相比，稻虾种养模式可以显著提升稻田土壤nosZ基因丰度。

2.4 稻虾种养对土壤中nosZ基因物种组成的影响

在水稻抽穗期，对CR处理和MR处理nosZ基因微生物进行目、科、属、种的物种分类学水平韦恩（Vern）分析，结果见图3。在目和科水平上，CR处理和MR处理具有相同的10个目（图3-a）和12个科（图3-b），在目和科水平的群落组成上表现出极大的相似性;在属水平上，CR处理和MR处理有17个相同的属，MR处理独有红假单胞菌属（图3-c）;在种水平上，CR处理和MR处理有19个相同的种，MR处理独有沼泽红假单胞菌（图3-d）。分析表明，在科水平以上，稻虾种养模式（CR）nosZ基因微生物群落组成与常规稻田表现出极大的相似性，在属和种水平上，2个处理之间的微生物群落组成存在差异，稻虾种养模式（CR）缺失红假单胞菌属下的沼泽红假单胞菌。

2.5 稻虾种养模式对nosZ基因物种目水平相对丰度的影响

样品获得的nosZ基因微生物物种分类在2个域、2个界、4个门、6个纲、10个目、12个科、18个属和20个种。将无法分类的序列定义为无法归类，样品获得的nosZ基因OTUs在分类学界、门、纲、目、科、属、种水平上可归类比例为 95.0%、95.0%、90.0%、85.0%、75.0%、50.0%、35.0%。

在目水平上，未分类c_β-变形菌目、未分类_p_变形菌目、嗜氢菌目、红环菌目、未分类_k_norank d_细菌目、根瘤菌目是2个处理平均相对丰度同时大于1%的6个优势菌目（图4），CR处理3次重复平均相对丰度分别为52.45%、29.49%、6.72%、5.57%、2.91%、1.82%;MR处理3次重复平均相对丰度分别为58.43%、15.57%、8.85%、9.77%、2.98%、2.40%。对nosZ目水平上相对丰度大于>0.1%的群落物种进行显著性分析，结果（表4）显示，红环菌目在CR处理中的相对丰度显著低于MR处理（P<0.05），norank_p_environmental_samples在CR处理中的相对丰度显著高于MR處理（P<0.05）。稻虾种养模式显著降低了红环菌目的相对丰度，增加了norank_p_environmental_samples的相对丰度，改变了nosZ基因微生物目水平相对丰度的组成。

2.6 nosZ型反硝化细菌群落结构与土壤理化性质的相关性

对97%相似水平上的OTU代表序列进行决策曲线分析法（decision curve analysis，简称DCA）进行分析，看分析结果中lengths of gradient 的第一轴的大小，如果大于4.0，就应该选典型关联分析（canonical correlation analysis，简称CCA），如果介于3.0～4.0之间，选RDA和CCA分析均可，如果小于3.0，RDA分析优于CCA分析。分析结果中lengths of gradient第一轴的大小为0.553，因此选用RDA分析环境因子、样本、菌群三者间的关系。

对nosZ群落结构与土壤理化性质进行冗余分析，结果（图5）表明，2个排序轴共解释了98.35%的变化，第一排序轴（RDA1）解释了95.56%的群落变化，第二排序轴（RDA2）解释了2.79%的变化。第一排序轴与土壤全碳（TC）含量、pH值、硝态氮（NO3--N）含量的关系最为密切，第二排序轴与土壤碱解氮（AN）含量的关系最为密切。总体而言，土壤全碳（TC）含量对群落结构的影响最为显著（R2=0.482 8），影响顺序依次是土壤总碳含量>pH值>碱解氮含量>硝态氮含量>铵态氮含量。沿第一排序轴看，稻虾种养的3个样本全部分布在常规中稻处理左侧，其中CR2、CR3分别与常规中稻的MR1、MR2、MR3样本距离较近，而CR1处理与其他样本距离较远。表明2个处理群落结构存在差异，但稻虾种养模式与常规稻田模式在群落结构上仍保留着一定的相似性，土壤总碳含量是影响2种模式群落结构的主效因子。

3 讨论与结论

佀国涵等研究表明，长期稻虾轮作显著提高水稻土0～40 cm 耕层有机碳、全钾、碱解氮含量，0～30 cm耕层的土壤全氮含量及0～10 cm土壤速效钾、全磷含量在稻虾轮作下也显著提高，该模式可改善土壤结构增加土壤养分[19]。金乃康研究结果显示，稻虾种养模式下虾子的粪便可增强土壤肥力，减少化肥使用量，在降低生产投入的情况下又可提高农田利用效率与经济效益[20]。本研究的结果与前人研究基本一致，与常规中稻种植模式相比，稻虾轮作模式显著提高了土壤全氮、全碳、硝态氮含量。目前，稻虾稻田种养复合模式的研究多数集中在土壤物理化学性质、稻虾田温室气体以及稻虾种养技术等方面，对于稻虾土壤反硝化微生物方面的研究较少。研究结果表明，稻田养虾对nosZ基因微生物群落丰富度及群落多样性的影响均不显著。稻虾种养模式与常规中稻种植模式nosZ基因微生物群落结构存在差异，但二者在群落结构上仍保留着一定的相似性。该结果与之前的研究发现一致，在不同的土地利用方式、不同环境条件下，nosZ基因的微生物群落组成变化不大，nosZ基因微生物群落在土壤中相对比较稳定，受到环境条件影响的变化不大[21-22]。在中稻抽穗期，稻虾种养模式nosZ基因丰度是常规中稻种植模式的1.48倍，显著提升了稻田土壤中nosZ基因的丰度。稻虾种养模式显著提升了土壤中硝态氮含量，而NO3--N是反硝化反应第1步硝酸还原反应的底物，反应生成的N2O是nosZ基因编码的N2O还原酶的原料，能够促进nosZ的增长。所以，硝态氮间接地为nosZ基因微生物提供了原料，促进了nosZ基因丰度的增加[9]。沼泽红假单胞菌是一种菌体富含蛋白质、维生素、类胡萝卜素等营养物质，被广泛应用于渔业的光合细菌，作为饲料添加剂可以有效地提高饲料效率，促进鱼虾生长[23]。沼泽红假单胞菌和红螺菌同属红螺菌科，二者生存条件相似，均是在光照和厌氧条件下适宜生长[24]。稻虾种养模式缺失沼泽红假单胞菌可能与缺失红螺菌的原因相似，一方面是抽穗期株高较高，遮光效应不利于沼泽红假单胞菌的生长;另一方面可能在浅水状态下，克氏螯虾的扰动带入了水体氧气，打破了厌氧环境，不利于沼泽红假单胞菌的生长[25]。Miller等在研究短期内（72 h）碳源对小麦反硝化基因丰度的影响发现，碳含量较高是氮施入可以提高反硝化微生物丰度的前提[26]。自然界中多种环境因素，如土壤pH值[27]、土壤含氧量[28-29]、土壤温度[30]、土壤含水量[31]、土壤中的养分供应状况[32]以及植物种类[33-34]等均能够影响反硝化细菌群落的结构。续勇波等认为，凡是能促进土壤碳、氮积累和厌氧微生物活性的土地利用方式和耕作管理措施均会促进反硝化作用进行，可见碳、氮是影响反硝化活性的主要因子[35]。本研究结果显示，土壤总碳是影响2种模式nosZ基因微生物群落结构的主效因子，与前人的研究结果基本一致。此外，由于稻虾田土壤的环境较为复杂，须经历干湿交替阶段，且受水稻植株根系分泌物的影响，因此对于稻虾土壤反硝化细菌群落的研究也就更为复杂，须要更加深入系统的研究。

本研究结论如下：（1）相比常规中稻种植模式，稻虾共作显著增加了水稻土壤硝态氮、全碳、全氮含量，对土壤pH值、碱解氮含量及土壤碳氮比无显著影响。（2）本研究借助荧光定量PCR对常规中稻种植模式与稻虾共作模式下的土壤反硝化细菌nosZ基因数量进行研究，结果表明，稻虾共作模式中nosZ基因丰度显著高于常规中稻种植模式。（3）与常规中稻种植模式相比，稻虾种养模式没有显著改变nosZ基因微生物群落丰富度及群落多样性。在目和科水平以上，稻虾种养模式nosZ基因微生物群落组成与常规稻田表现出极大的相似性;在属和种水平，2个处理微生物群落组成存在差异，稻虾种养模式缺失红假单胞菌属下的沼泽红假单胞菌。2种种植模式群落结构存在差异，但稻虾种养模式与常规稻田种植模式在群落结构上仍保留着一定的相似性。与常规中稻种植模式相比，稻虾种养模式显著降低了红环菌目的相对丰度，改变了nosZ基因微生物目水平相对丰度的组成。此外，土壤pH值、碱解氮含量、硝态氮含量、铵态氮含量与群落结构存在显著相关关系，而土壤总碳含量是影响2种模式nosZ基因微生物群落结构的主效因子。

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