两种测定植酸酶酶活的方法比较及发酵条件研究

徐丹丹 赵邯郸 王秀然 关淑艳

摘要：从富含有机质的环境中采集土样，通过植酸钙平板透明圈法初筛得到产植酸酶菌株，进而用钒-钼酸铵法和丙酮-磷钼酸铵法2种方法测定植酸酶酶活力，并进行比较。结果表明，钒-钼酸铵法为准确、可用的方法，通过正交试验确定了最适产酶发酵条件为pH 5，可溶性淀粉用量1.25 g/100 mL，酵母粉用量1.80 g/100 mL，植酸钙用量1.0 g/100 mL。

关键词：植酸酶;酶活;测定;钒-钼酸铵法;丙酮-磷钼酸铵法

中图分类号：Q93-332         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）12-0134-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.031           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The soil sample was collected from the organic-rich environment， and phytase production strains were obtained by preliminary screening with calcium phytate plate transparent ring method. Then phytase activity was determined by two different methods vanadium-ammonium molybdate method and acetone-ammonium phosphomolybdate method， and then compared. The results showed that the method of vanadium-ammonium molybdate was accurate and available. The orthogonal fermentation test determines that pH is 5， the yield of soluble enzyme is 1.25 g/100 mL， the optimum dosage of yeast powder is 1.80 g/100 mL， and the amount of calcium phytate is 1.0 g/100 mL.

Key words： phytase; enzyme activity; measure; vanadium-ammonium molybdate method; acetone-ammonium phosphomolybdate method

植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐广泛存在于植物体中，是植物磷的主要贮存形式，占植物中总磷的60%～80%[1]。但植酸磷难以被单胃动物吸收利用，随粪便排出体外会造成水体和土壤的严重磷污染[2]。同时，植酸及其盐还是一种抗营养因子，能与多种金属离子螯合并能与蛋白质等形成难溶的复合物，影响动物对矿质元素和蛋白质的吸收利用[3，4]。植酸酶能将植酸及其盐类降解为肌醇和磷酸（或磷酸盐），作为饲料添加剂可以提高植酸磷的利用率，提高植物性飼料的营养价值，减少畜禽粪便中磷的排放，减轻环境污染[5-7]。传统的产植酸酶菌株的筛选方法为透明圈法，该方法利用微生物在植酸酶筛选培养基上降解植酸钙，在菌落周围生成透明圈来初步判断微生物是否产植酸酶，但有些产酸菌株也能降解植酸钙产生透明圈，故平板透明圈法缺乏特异性和绝对性，必须再对产透明圈的菌株进行液体发酵培养，测定发酵液的植酸酶活性，才能判断出该菌株是否能够产植酸酶。植酸酶活性的测定方法较多，有钒-钼酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、丙酮-磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等[8]。本研究从土壤中粗筛出产植酸酶的菌株，通过钒-钼酸铵法和丙酮-磷钼酸铵法2种方法测定酶活力，确定最适宜本试验菌株的酶活测定方法，为后续试验奠定基础。

1  材料与方法

1.1  菌株

试验菌株为前期实验室所筛产植酸酶菌株。

1.2  主要试剂

植酸钠（P8810，Sigma公司）;植酸钙（阿拉丁试剂）;其余试剂均为分析纯。

1.2.1  丙酮-磷钼酸铵法  丙酮-磷钼酸铵法测定酶活所需试剂如表1所示。

1.2.2  钒-钼酸铵法  钒-钼酸铵法测定酶活所需试剂如表2所示。

1.3  主要设备

721型分光光度计，PHS-3TC型精密数显酸度计，离心机。

1.4  方法

1.4.1  粗酶液的获得  将实验室前期筛选的植酸酶菌株用马丁斜面进行活化，再从活化斜面取孢子接入4瓶盛有100 mL液体发酵培养基的250 mL摇瓶中，置于26 ℃、150 r/min摇床发酵4 d，过滤离心获得发酵上清液。

1.4.2  发酵条件的研究  实验室前期已经筛选出最适碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母粉。对二者用量进行发酵优化，以确定最佳碳氮源以及植酸钙用量，同时选出产酶最适的pH，发酵获得的粗酶液分别用2种方法进行酶活测定。

1）可溶性淀粉用量。将淀粉按0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/100 mL添加到发酵培养基中，确定其最佳用量。

2）酵母粉用量。将酵母粉按1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/100 mL添加到发酵培养基中，确定其最佳用量。

3）植酸钙用量。调整培养基中植酸钙的用量，在培养基中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/100 mL，测定酶活，以确定植酸钙的最佳用量。

4）初始pH筛选。调节培养基的初始pH，使其分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，测定酶活，以确定产酶最适初始pH。

1.4.3  丙酮-磷钼酸铵法测定不同发酵条件下植酸酶酶活

1）磷标准曲线的绘制。配制浓度分别为0.9、1.2、1.8、2.4、3.0 mmoL/L的磷酸二氢钾溶液，各吸取2 mL，再加入显色液AAP 8 mL，摇匀显色5 min，加入1.0 mL柠檬酸溶液，混匀后在415 nm处比色测定，绘制磷浓度与吸光度的关系曲线，以不加磷酸二氢钾溶液而补加去离子水作为空白。

2）酶活测定。以每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol无机磷为一个酶活单位（U），稀释发酵液到酶活标准曲线范围内，吸取酶液0.5 mL，加入植酸钠溶液0.5 mL。37 ℃水浴60 min，然后加入显色液AAP 8 mL，摇匀显色5 min，加入1.0 mL柠檬酸溶液，以柠檬酸灭活的稀释酶液相同处理作为对照在415 nm處比色测定。

式中，P为对照标准曲线查得的反应液中总磷的浓度;P0为对照标准曲线查得的反应液中本底磷的浓度;20为分析酶液时的总稀释倍数;n为稀释酶液的总稀释倍数;t为酶反应时间。

1.4.4  钒-钼酸铵法测定不同发酵条件下植酸酶酶活

1）磷标准曲线的制备。将磷酸二氢钾母液按照梯度进行稀释，稀释倍数为2、4、8、16、32倍，溶液浓度分别为25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 mol/L，在415 nn波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，无机磷浓度为横坐标，列出直线回归方程。

2）酶活测定方法。以每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol无机磷为1个酶活单位（U）。取10 mL试管进行操作。首先将0.9 mL乙酸缓冲液与0.2 mL待反应液混合，水浴锅37 ℃预热5 min，然后加入2 mL植酸钠，混匀后水浴锅37 ℃水解30 min，最后加入2 mL终止液。反应后的试样在室温下静置10 min，如出现混浊需在离心机上4 000 r/min离心10 min，取上清液以标准空白调零，在分光光度计415 nm波长处测定样品吸光度，根据公式计算酶活。

式中，U为试样中植酸酶的活性（U/mL）;c为根据实际样液的吸光度由直线回归方程计算出的y值;F为试样溶液反应前的总稀释倍数;v为试样反应体积（mL）;30为反应时间（min）。

2  结果与分析

2.1  不同方法测定酶活磷标准曲线的绘制

2.1.1  丙酮-磷钼酸铵法磷标准曲线  按照“1.4.3”的方法制作磷标准曲线，以磷浓度为横坐标，OD415 nm的值为纵坐标绘制磷标准曲线，结果如图1所示。

2.1.2  钒-钼酸铵法磷标准曲线  按照“1.4.4”的方法制作磷标准曲线，以吸光度为纵坐标，无机磷浓度为横坐标，结果如图2所示。

2.2  不同方法测定不同发酵条件下植酸酶酶活

2.2.1  可溶性淀粉最佳用量筛选  将加入不同量淀粉的培养基进行振荡培养，用2种方法测定植酸酶酶活，两者之间的差异很小，确定出其最佳用量为1.25 g/100 mL，结果如图3所示。

2.2.2  酵母粉最佳用量筛选  将加入不同用量酵母粉的培养基进行振荡培养，用2种方法测定植酸酶酶活，所得酶活变化趋势相同，确定酵母粉最佳用量为1.80 g/100 mL，结果如图4所示。

2.2.3  植酸钙最佳用量筛选  由图5可知，对加入不同植酸钙的培养基进行振荡培养，用2种方法测定植酸酶酶活，两者之间的差异很小，确定植酸钙的最佳用量为1.0 g/100 mL。

2.2.4  不同初始pH的筛选  改变培养基中pH，用2种发法测定粗酶液酶活力，丙酮-磷钼酸铵法虽然测出了植酸酶的酶活，但均值在60 U/mL左右，没有显示出酶活差异，出现较大误差;通过钒-钼酸铵法测定植酸酶的酶活，可以看出植酸酶酶活最佳pH为5，结果如图6所示。

2.3  正交试验

将所选的最佳碳氮源淀粉用量、酵母粉用量、初始pH及植酸钙用量进行正交试验分析，确定出最佳的培养基成分。由表3可知，影响植酸酶酶活的主次因素为植酸钙用量（A）>可溶性淀粉用量   （B）>pH（C）>酵母粉用量（B），其最佳组合方案为A2B2C2D2，即100 mL液体培养基中含有1.25 g淀粉、1.80 g酵母粉、pH 5、植酸钙1.0 g。

3  小结

通过摇菌获得植酸酶粗酶液，通过2种方法对其进行酶活检测，并进而进行发酵条件的研究，确定出最佳培养基组成。钒-钼酸铵法被确定为本试验最适宜的酶活检测方法。现在测定植酸酶酶活的方法在逐渐改进，但是也没有明确的指定测定方法，本试验采用2种方法测定植酸酶酶活，出现了较大差异，其原因正在进一步验证中。因本次筛选的植酸酶菌株可能为一种新的菌种，其生理生化规律有待进一步研究。

参考文献：

[1] 施安辉，王光玉，李桂杰，等.目前国内外植酸酶研究进展[J].中国酿造，2005，146（5）：5-10.

[2] 梁欣，于晓丽.植酸酶在家禽饲料中应用的研究进展[J].山东畜牧兽医，2012，183（4）：81-83.

[3] SONI S K，MAGDUM A，KHIRE J M.Purification and characterization of two distinct acidic phytases with broad pH stability from Aspergillus niger NCIM 563[J].World J Microbiol Biotechnol，2010，26（11）：2009-2018.

[4] LIEBERT F，PORTZ L.Different sources of microbial phytase in plant based low phosphprus diets of Nile tilapia Oreochromis niloticus may provide different effects on phytate degradation[J].Aquaculture，2007，267（1-4）：292-299.

[5] ZHANG R，YANG P L，HUANG H Q，et al.Two types of phytases（histidine acid phytase and beta-propeller phytase） in Serratia sp. TN49 from the gut of Batocera horsfieldi（coleoptera） larvae[J].Curr Microbiol，2011，63（5）：408-415.

[6] HUANG H，ZHANG R，FU D，et al. Diversity，abundance and characterization of ruminal cysteine phytases suggest their important role in phytate degradation[J].Environ Microbiol，2011，

13（3）：747-757.

[7] FORTES-SILVA R，SANCHEZ-VAZQUEZ F J，MARTINEZ F J.Effects of pretneating a plant-based diet with phytase on diet selection and nutrient uticization in European sea bass[J].Aquaculture，2011，319（3）：417-422.

[8] 程海娜.黑曲霉植酸酶菌株選育及其酶的分离纯化和性质研究[D].长沙：湖南师范大学，2003.

收稿日期：2019-01-15

作者简介：徐丹丹（1989-），女，吉林德惠人，在读硕士研究生，研究方向为重要农艺性状基因的分离功能鉴定及品种改良，