儿童肺炎支原体肺炎外周血miRNA-492的表达

孙旦　李玉琴　丁莹　雷小丽　骆亚丽　周卫芳

【摘要】 目的 探讨miRNA-492在儿童支原体肺炎中的作用，进一步了解支原体感染的免疫致病机制。方法 选取2014年3月至2015年6月期间住院治疗，确诊为肺炎支原体肺炎患儿23例作为实验组（MPP组），同时期健康儿童20例作为对照组（NC组），采用ELISA法检测TNF-α、IL-6，RT-qPCR法检测HMGB1及miRNA-492的表达量，分析两组实验室检查结果、免疫球蛋白水平及淋巴细胞亚群分布，探讨miRNA-492与TNF-α、IL-6、HMGB1及其他实验室指标的相关性。结果 肺炎支原体肺炎组患儿外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表达水平均高于健康对照组（P<0.05）。MPP组miRNA-492与Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 细胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均无明显相关性（P>0.05），与HMGB1呈负相关（P<0.01）。結论 miRNA-492、TNF-α、IL-6及HMGB1在肺炎支原体肺炎感染和发病中起一定作用，作用机制可能不同。

【关键词】 肺炎支原体肺炎;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

中图分类号：R725.6   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.06.006

【Abstract】 Objective To investigate the role of miRNA-492 in children with mycoplasma pneumoniae pneumonia and to further understand the immune pathogenic mechanism of mycoplasma infection.Methods 23 children diagnosed with mycoplasma pneumonia during hospitalization from March 2014 to June 2015 were selected as experimental group（MPP group），and 20 healthy children in the same period were selected as control group（NC group）.And then，TNF-α and IL-6 were detected by ELISA，and the expression of HMGB1 and miRNA-492 by RT-qPCR.The results of laboratory examination，immunoglobulin levels and the distribution lymphocyte of subsets in the two groups were analyzed.In addition，correlation between miRNA-492 and TNF-α，IL-6，HMGB1 and other laboratory indexes was explored.Results The expressions of microRNA492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 in peripheral blood of children with mycoplasma pneumoniae pneumonia were higher than those of healthy control group（P<0.05）.In the MPP group，miRNA-492 was not obviously correlated with TNF-α，IL-6，Neut，Lymph，CRP，AST，LDH，HBDH，PA，IgA，IgG and the percentages of CD3+CD4+，NK cell and CD19+CD23+（P>0.05），but it was negatively correlated with HMGB1（P<0.01）.Conclusion MiRNA-492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 play certain roles in the immune pathogenesis of mycoplasma pneumoniae pneumonia，but their mechanisms of action may be different.

【Key words】 mycoplasma pneumoniae pneumonia;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

肺炎支原体（MP）是儿童社区获得性肺炎的常见病原菌，体液免疫、细胞免疫和细胞因子在肺炎支原体肺炎（MPP）发病机制中起到重要作用[1～4]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度为20～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，miRNA-492是灵长类动物特有的miRNA[5]。miRNA-492可调控多种蛋白表达，在肿瘤发生和转移、胰岛素抵抗、自身免疫等生物进程中起到重要作用，在支原体感染中鲜有文献报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2014年3月至2015年6月期间在苏州大学附属儿童医院住院治疗，确诊为肺炎支原体肺炎患儿23例作为研究对象（MPP组），同期健康体检儿童20例作为对照（NC组），入院后采集2 mL外周血，ELISA法检测TNF-α、IL-6，RT-qPCR法检测HMGB1及miRNA-492的表达量，回顾性分析其实验室检查、免疫球蛋白水平检测及淋巴细胞亚群检测。其中MPP组患儿男14例，女9例，平均年龄（6.72±2.93）岁;NC组健康儿童男11例，女9例，平均年龄（6.42±2.67）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。MPP组所有入选病例符合肺炎支原体肺炎诊断标准[6]，排除常见的病毒、衣原体、结核菌的感染以及肿瘤发生转移、胰岛素抵抗、自身免疫性疾病。NC组符合下列条件：同时期内无器质性疾病、3个月内无急性感染性疾病史的健康儿童。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有病例入院后次日清晨采集空腹抗凝血2 mL，2小时内4℃，2500 rpm离心10分钟，吸取上层黄色血浆-80℃冻存。剩余血细胞按红细胞裂解法分离获得白细胞，加入1 mL Trizol吹打混匀得到白细胞Trizol混合液，-80℃冻存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-492的表达 23例MPP组及20例NC组的白细胞Trizol混合液冰上溶解，提取并纯化RNA，分光光度计测定RNA的质量和浓度。miRNA-492以U6为内参，HMGB1以β-actin为内参，按照灏勤生物公司miRNA/mRNA实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒说明书测定样本中miRNA-492及HMGB1的表达，采用相对表达量2-△△Ct法比较各基因的表达差异。

1.2.3 流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群 淋巴细胞亚群的检测运用BD FACSCalibur公司流式细胞仪进行多参数分析。

1.2.4 ELISA 檢测 采用联科生物技术公司 ELISA试剂盒检测血浆 TNF-α、IL-6表达水平，具体操作方法严格按照说明书步骤进行。

1.3 统计学方法 统计学分析采用SPSS 17.0软件包，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料以百分比或率表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。相关性分析采用Spearson秩相关分析。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果

2.1 MPP组患儿与NC组儿童实验室指标比较 两组儿童实验室指标比较共有12项指标差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表1。

2.2 MPP组患儿与NC组儿童miRNA-492及细胞因子比较 MPP组患儿外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表达水平均高于NC组儿童，两者之间差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 miRNA-492水平与差异表达的实验室指标及细胞因子相关性 MPP组miRNA-492与Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 细胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均无明显相关性（P>0.05），与HMGB1呈负相关（P< 0.01）。见表3。

3 讨  论

肺炎支原体肺炎曾被当作一种自限性疾病，并不受到重视。但近年来，难治性肺炎支原体肺炎及支原体肺炎造成的肺外并发症也可能给患者造成严重的组织器官损伤;同时也有研究表明，肺炎支原体的感染可能与哮喘发病密切相关[7]。本组支原体肺炎患儿外周血CRP、中性粒细胞数等炎性指标明显增高，淋巴细胞数降低、前白蛋白减少明显，考虑与MP感染后引起机体较强的炎症反应有关。MP感染后易引起肺外损伤，其中以肝功能及心脏损伤最为多见。本组支原体肺炎患儿外周血HBDH、LDH、AST增高，心肌酶的增高考虑与MP感染导致的免疫激活相关。

免疫机制在肺炎支原体的感染和MPP发病过程中起到了重要的作用，目前尚未完全明了。一方面，肺炎支原体可在体内诱发体液免疫应答，刺激B细胞产生免疫球蛋白，形成免疫复合物。另一方面，肺炎支原体的表面抗原与人体多种组织器官表面抗原相似，还可改变部分人体细胞表面抗原表达，诱发免疫细胞对自身组织的攻击[8]，导致被感染者免疫紊乱。

TNF-α是机体重要的内源性炎症因子，文献报道TNF-α参与重症肺炎所致的肺损伤[9]，本研究结果显示MPP组患儿的TNF-α水平高于NC组，提示TNF-α参与了肺炎支原体肺炎的发病过程。IL-6水平增高是最早出现的感染指标。IL-6是MPP炎症反应中的重要细胞因子，在免疫应答的早期即发挥重要作用[10]。本研究结果显示MPP组患儿的IL-6高于NC组，提示IL-6参与了肺炎支原体肺炎的发病过程。HMGB1是一种保守的非组蛋白核蛋白，尹力等人[11]研究显示HMGB1在肺炎患者血液中高度表达（P<0.05），可能提示疾病的严重程度。本研究结果显示MPP患儿血浆HMGB1的含量明显高于健康对照组，提示HMGB1参与了肺炎支原体肺炎的发病过程。

miRNA作为近年来备受关注的一类内源性非编码小RNA，在多种生物学进程中发挥重要作用。本课题组前期研究应用miRNA芯片技术比较MPP组与NC组儿童外周血血浆中miRNA的表达谱，筛选出26条差异表达的miRNAs，19条miRNAs上调，7条miRNAs下调，提示miRNAs参与机体对肺炎支原体的免疫应答反应，并对miRNA-492 及miRNA-222-3P进行了验证[12]。

miRNA-492位于12q22染色体上，序列为AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU，是灵长类动物特有的miRNA，在肿瘤的发生、生长、转移及胰岛素抵抗等生物过程中起重要作用，同时，由于miRNA在组织细胞内和外周血液系统中均有存在，并且不受内源性RNA酶的影响，稳定性较好，因此，亦有文献报道miRNA-492可作为生物标记物，用于疾病的诊断中[13]。但在支原体肺炎的诊断敏感性和特异性未做ROC曲线分析，因样本量较小，且除了健康对照组以外还需要做一些病毒性、细菌性肺炎标本作为对照才有意义。miRNA-492在感染性疾病的研究甚少，RT-PCR结果显示，与健康对照儿童相比，miRNA-492在肺炎支原体患儿的外周血中水平显著升高，推测miRNA-492在肺炎支原体肺炎发病过程中起到一定作用。然而，本研究将miRNA-492水平与肺炎支原体肺炎患儿差异表达的实验室指标及炎症因子进行相关性分析，发现miRNA-492与HMGB1呈负相关，与其他指标无相关性。究其原因，可能是由于miRNAs的调控作用是一系列非常复杂的网络，具有较强的时间性和空间性，所以，miRNA-492和肺炎支原体肺炎患儿的相关实验室指标、TNF-α、IL-6的调节并不具有明显相关性，而HMGB1作为晚期炎症因子在炎症反应中常常出现得比较晚，在支原体感染中的研究也极少，且本次研究病例较少，生物学信息分析miRNA-492下游的靶基因较多，是否存在哪一个靶基因调节HMGB1的表达在今后的实验中有待进一步研究。