原发性肾病综合征患者尿液中podocalyxin、nephrin的表达及意义

吴好好　郑心彤　黄海庭　林栩

【摘要】 目的 探討不同病理类型的原发性肾病综合征患者尿中podocalyxin、nephrin的表达及意义。方法 将80例原发性肾病综合征患者，按照病理分为微小病变性肾病（MCN）组22例、系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）组11例、膜性肾病（MN）组36例、局灶性节段性肾小球硬化（FSGS）组11例，另设20例健康人为对照组。通过酶联免疫吸附法检测各组尿中podocalyxin、nephrin的表达，并分析其与24小时尿蛋白、血清白蛋白、血脂、肌酐的相关性。结果 FSGS组尿podocalyxin、nephrin高于其他肾病综合征组和正常对照组（P<0.05），其他肾病综合征组高于正常对照组（P<0.05）;MsPGN组尿podocalyxin、nephrin低于其他肾病综合征组（P<0.05），其在MCN、MN组表达差异无统计学意义（P>0.05）;不同病理类型肾病综合征组尿podocalyxin、nephrin的表达与血清白蛋白呈负相关，与24小时尿蛋白、血脂、肌酐水平呈正相关（P均<0.05）。结论 尿podocalyxin、nephrin的表达水平与肾病综合征病理类型及疾病严重程度相关，可作为判断肾病综合征病理类型和预后的参考指标。

【关键词】 原发性肾病综合征;podocalyxin;nephrin;足细胞损伤

中图分类号：R692.6   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.06.004

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of podocalyxin and nephrin in urine of patients with different pathological types of primary nephrotic syndrome.Methods According to pathology，80 patients with primary nephrotic syndrome were divided into minimal change nephropathy（MCN） group（22 cases），mesangial proliferative glomerulonephritis（MsPGN） group（11 cases），membranous nephropathy（MN） group（36 cases） and focal segmental glomerulosclerosis（FSGS） group（11 cases）.In addition，20 healthy people were selected as control group.And then，the expression of podocalyxin and nephrin in urine was detected by enzymelinked immunosorbent assay，and its correlation with 24hour urinary protein，serum albumin，blood lipid and creatine was analyzed.Results The urinary podocalyxin and nephrin in the FSGS group were higher than those in other nephrotic syndrome groups and the control group（P<0.05），while those in other nephrotic syndrome groups were higher than those in the control group（P<0.05）.The urinary podocalyxin and nephrin levels in MsPGN group were lower than those in other nephrotic syndrome groups（P<0.05），and there was no statistically significant difference in the expressions of podocalyxin and nephrin between the MCN group and the MN group（P>0.05）.The expression of urinary podocalyxin and nephrin in different pathological types of nephrotic syndrome was negatively correlated with serum albumin，and positively correlated with 24hour urinary protein，blood lipid and creatine level（all P<0.05）.Conclusion The expression levels of urinary podocalyxin and nephrin are related to the pathological type and severity of nephrotic syndrome，which can be used as a reference index to judge the pathological type and prognosis of nephrotic syndrome.

【Key words】 primary nephrotic syndrome;podocalyxin;nephrin;podocyte injury

原发性肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是常见的肾小球疾病，肾小球足细胞损伤是该病发生发展的重要环节。众多研究表明通过检测尿液中足细胞相关蛋白的含量可以间接反映尿液中足细胞数量的多少，进而判断肾小球足细胞损伤程度。因此本实验拟通过探讨足细胞相关蛋白podocalyxin、nephin在原发性NS不同病理类型患者尿液中的表达与临床相关指标（尿蛋白、白蛋白等）的相关性，为NS诊断及预后判断提供新思路。

1 资料与方法1.1 研究对象 收集2016年8月至2017年8月在右江民族医学院附属医院及百色市人民医院肾内科首次住院经临床及肾脏病理检查诊断为原发性肾病综合征患者的尿液共80例，男性43人，女性37人，年齡11～78岁，平均（37.75±16.81）岁;排除狼疮性肾炎、药物中毒、糖尿病肾病、细菌感染、紫癜性肾炎、肾淀粉样变、乙肝病毒相关性肾炎、肿瘤性肾病等继发性肾病综合征。其中微小病变性肾病（MCN）22例，男性13人，女性9人，平均（24.55±12.27）岁;系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）11例，男性7人，女性4人，平均（36.27±10.96）岁;膜性肾病（MN）36例，男性17人，女性19人，平均（47.56±14.80）岁;局灶节段性肾小球硬化（FSGS）11例，男性6人，女性5人，平均（33.55±16.62）岁。随机选取同期健康体检的20例健康者作为对照组，男性11人，女9人，年龄12～78岁，平均（3995±17.80）岁。原发性肾病综合征组患者的性别、年龄与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经右江民族医学院附属医院和百色市人民医院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 血液标本收集及检测 80 例患者于治疗前采集清晨空腹静脉血 3 mL，同期采集健康对照者静脉血 3 mL，采用全自动生化分析仪检测血清白蛋白、胆固醇、甘油三酯、肌酐水平。

1.2.2 尿液标本的收集与处理 收集不同病理类型患者清晨首次清洁中段尿10 mL，并收集健康对照组患者的尿液标本，2500 r/min离心，10 min后将上清保存在-20℃低温冰箱，避免反复冻融，用于podocalyxin、nephrin的检测。同样处理的相同尿液保存在-80℃超低温冰箱，备用。

1.2.3 主要仪器与试剂 Rayto 酶联仪，人podocalyxin、nephrin ElISA检测试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司）。

1.2.4 尿podocalyxin、nephrin检测 采用酶联免疫吸附法检测。检测步骤有如下几步。（1）标准品配制：标准品（10 ng）离心1 min，加入样品稀释液 1 mL，充分溶解后，室温下静置 10 min，使其浓度为 10 ng/mL。准备 7 个 1.5 mL EP 管，每管加入 500 μL 样品稀释液，然后做倍比稀释使这7个 1.5 mL EP 管内配成的浓度分别为 5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0312 ng/mL、0.156 ng/mL、0 ng/mL，最后从第6管中吸出 500 μL 弃去其中，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/mL，每份稀释后振荡器震荡数秒使其混匀。（2）加样：分别设置空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50 μL，余下的孔分别加标准品或待测样品50 μL，立即每孔加入生物素化抗体工作液50 μL。加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，给酶标板覆膜， 37℃孵育45 min。（3）洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，大约350/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。（4）加入酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液 100 μL，加上覆膜，37℃温育30 min。（5）洗板：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，大约350/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。（6）加入底物溶液：每孔中加入底物溶液（TMB） 90 μL，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 min左右（不能超过30 min）。（7）加入终止液：每孔中加终止液50 μL，终止反应，此时蓝色立即转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。（8）立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度（OD值）。（9）利用 Curveexpert 1.4 软件绘制出标准曲线，然后依据标本的OD值在标准曲线上求出podocalyxin、nephrin的浓度（ng/mL）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件处理数据，计量资料以（±s）表示，两组间计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，比较podocalyxin、nephrin在不同病理类型肾病综合征的表达采用单因素方差分析，两两比较时，方差齐使用LSD法，方差不齐则使用GamesHowell法，相关性分析采用Pearson相关分析，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果2.1 各组临床相关指标的比较 与对照组相比，各组24 h尿蛋白均升高，血清白蛋白不同程度降低，并伴有血脂、肌酐升高。见表1。

2.2 各组尿液中podocalyxin、nephrin的表达水平 podocalyxin、nephrin在正常人及肾病综合征组患者尿液中均存在，对照组尿液中podocalyxin、nephrin的表达显著低于肾病综合征组（P<0.05）。肾病综合征MsPGN组尿液中podocalyxin、nephrin的表达最低、FSGS组最高;MN组与MCN组尿podocalyxin、nephrin差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组尿液中podocalyxin、nephrin与临床指标的相关分析 各组尿液中podocalyxin、nephrin的表达与24 h尿蛋白呈正相关（r=0.60，r=0.56，P均<005）;与血清白蛋白呈负相关（r=-0.47，r=-058，P均<005）;与胆固醇呈正相关（r=044，r=037，P均<005）;与甘油三酯呈正相关（r=048，r=032，P均<005）;与肌酐呈正相关（r=024，r=030，P均<005）。见表3。