桔梗皂苷-纳米硒复合物对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用①

高金波， 侯丽然， 李国清， 张云杰， 彭 翔

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007； 3.哈尔滨学院生命科学与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

0 引 言

桔梗为药食两用植物，是桔梗科(Campanulaceae)植物桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A. DC. 的干燥根，始载于《神农本草经》[1]。已有研究表明桔梗中的化学成分主要有：桔梗皂苷、酚类化合物、黄酮类化合物等[2,3]。其中的桔梗皂苷具有祛痰、镇痛、抗炎、保肝、降脂等作用[4]。根据桔梗皂苷的结构可知：分子中和分子间均有一定的网状空间，溶液中的小分子或离子可以进入网状空间，具有一定的分散能力[5]。硒是人体的必须微量元素之一，是人体合成许多酶的重要组成部分，具有清除自由基、解除重金属的毒害与致癌性物质伤害[6]。自1994年张劲松、高学云博士率先研制出纳米硒之后，红色的纳米硒因其低的毒性和高的生物活性越来越备受关注[7]。近年来关于纳米硒的应用研究主要集中在光电子方面，鲜有利用纳米硒参与谷胱甘肽过氧化物酶进行保肝的研究。笔者已开展过利用纳米硒进行保肝的研究[8,9]，取得了一些进展，为寻找更稳定和更好的保肝物质，本文利用桔梗中的总皂苷作为分散剂制备红色的纳米硒，研究其对CCl4所致的肝损伤的保护作用，希望为保肝护肝提供有益的参考。

1 仪器与试剂

AU 2700全自动生化分析仪(1600T/h，日本OLYMPUS公司生产)，TGL16M台式高速低温冷冻离心机 上海赫田科学仪器有限公司，B×41 光学显微镜(OLYMPUS )。

SPF级昆明种雄性小鼠(佳木斯大学实验动物中心)；CCl4(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；联苯双酯滴丸(1.5mg×500丸，北京协和药厂)；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)试剂盒(日本，和光纯药工业株式会社)；丙二醛(MDA)试剂盒和还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 桔梗总皂苷的提取与处理

取干燥的桔梗，粉碎，过筛，称取50 g，30倍的蒸馏水，在60℃水浴，超声频率为1000W条件下超声60 min，四层纱布过滤，滤渣在上述条件下重复提取1次，合并滤液。滤液经过旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩液上101型大孔树脂柱，分别用蒸馏水和70%的乙醇洗脱，收集乙醇部分，浓缩至干，得桔梗总皂苷。

2.2 以桔梗总皂苷为分散剂制备PLD-NSe0的方法

称取0.1 g的桔梗总皂苷，加500 mL蒸馏水，在温度40 ℃下加入亚硒酸钠0.10g，搅拌30min，使其均匀地分散，再以1 mL/min的速度滴加维生素C(Na2SeO3与Vc的摩尔比为1∶3)，继续搅拌4 h，浓缩后，醇沉，离心。

2.3 桔梗皂苷-纳米硒复合物的保肝作用研究

2.3.1 动物分组及模型的建立

将48只雄性昆明种小鼠(SPF级)随机分成6组，分别为正常组，阴性模型组，阳性联苯双酯组，高、中、低剂量组，每组8只。正常饲养3d，称重，PLD-NSe0低、中、高剂量组分别按照40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg(含硒量)灌胃给药，阳性组灌联苯双脂200 mg/kg，正常组和阴性模型组按照100mL/kg灌胃生理盐水，连续灌胃给药14d，在第7d和第14d给药1h后，称重，除正常组外，各组小鼠按照10 mg/kg腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液。

2.3.2 血清和肝组织样本制备

在第14 d给药24 h后，称体重，眼球取血，血液于3500 r/min条件下低温离心15 min，取上清作为血清样本。将小鼠处死后摘取肝组织，用生理盐水冲洗，滤纸拭干，称重，计算肝指数(肝重/体重×100%)，取肝脏组织0.2 g，加预冷的9倍于组织块重的生理盐水，制备成10 %的肝组织匀浆液。将匀浆以3500r/min离心10～15min，取上清液作为肝组织匀浆液，备用。

2.3.3 血清肝功能各项指标的检测

取血清样本0.5mL于全自动生化检测仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)的含量，用以评价肝功能损伤程度。

2.3.4 肝组织中MDA含量和GSH-Px活力测定

取肝组织匀浆液，按照试剂盒要求测定并计算肝组织匀浆中MDA含量和GSH-Px活力。

2.3.5 病理组织学观察

选取小鼠右侧肝叶，置于10% 中性甲醛溶液中固定，按常规方法制备蜡块，切片，苏木素-伊红 (HE) 染色，封片，在光学显微镜下观察肝组织细胞的变化。

2.3.6 统计学方法

用统计SPSS 18.0软件包进行统计分析，在多组肝功能各项指标、MDA和GSH-Px的数据分析中，采用SPSS中的单因素方差分析法(One-Way Anova)，进行多重比较时，采用SPSS中的最小显著性法(LSD)。

3 结果与讨论

3.1 对小鼠体重的影响

按照2.3.1方法小鼠造模成功后，将小鼠称重并计算各组小鼠体重的平均值和标准偏差，汇总与表1。

表1 小鼠体重(g)值

根据0d～7d(ΔW0d-7d)的结果比较分析，正常组与联苯双酯组增加幅度较小，PLD-NSe0组的体重差随剂量增加，小鼠体重增长幅度变大。阴性组与低剂量组增长幅度几近相同。7d～14d与0d～7d体重差比较可知，正常组、联苯双酯组、PLD-NSe0高、中剂量组体重增长速度近乎相同，PLD-NSe0剂量组体重増长变缓，阴性组体重增长最慢，可推测CCl4造成小鼠肝细胞损伤，得了肝损伤，从而导致消化道不适，造成食欲差的结果。

3.2 对小鼠肝重及肝脏指数

由肝指数与组别之间绘制的柱状图如图1可看出，与正常组比较，阴性组小鼠肝重和肝指数存在极显著性差异(p<0.01)表明造模成功，而阳性联苯双酯组较正常组差异较小，说明联苯双酯具有保护和治疗作用；与阴性组比较，PLD-NSe0药物治疗组肝重与肝指数均明显低于阴性组且存在显著性差异(p<0.05)，与正常组和联苯双酯组无明显差异，说明PLD-NSe0有明显的保护肝脏和治疗肝损伤的效果，且治疗效果与PLD-NSe0的剂量正相关，可推测PLD-NSe0有助于修复肝细胞，使肝重指数降低的作用。

3.3 血清中酶的各种酶的变化

测定血清中TP、ALB、ALT、AST、GLB、ALP的酶活力，以评价肝损伤程度，测定结果见表2。

表2 小鼠肝功能测定结果

注：与正常组比较，*：p<0.01 ；与阴性组比较，#：p<0.05 ◆：p<0.01；与阳性组比较，^：p<0.05, ☉：p<0.01

由表2知，阴性组与正常组相比，阴性组小鼠血清中ALT、AST、ALP、GLB水平明显升高，均有极显著性差异(p<0.01)；阴性组小鼠血清中TP、ALB水平明显低于正常组，有极显著性差异(p<0.01)，说明CCl4引起的小鼠急性肝损伤的模型制造成功。联苯双酯阳性组与阴性模型组相比TP、ALB、ALT、AST、ALP、GLB均有极显著性差异(p<0.01)，且与正常组差异较小，说明联苯双酯滴丸有明显预防保护作用。PLD-NSe0低、中剂量治疗组较阴性组的TP、ALB水平明显升高，ALT、AST、ALP、GLB水平较阴性组明显降低，高剂量组则存在极显著性差异(p<0.01)，说明高剂量组治疗效果与阳性联苯双酯组相当。

图1 肝重指数柱图

3.4 PLD-NSe0对肝组织中MDA的含量的影响

由于CCl4在体内产生自由基引发脂质过氧化反应，从而损伤肝细胞，而丙二醛(MDA)是脂质过氧化的终产物，因此MDA的含量可以间接反应出肝细胞的破坏程度。由表3小鼠肝组织中MDA的含量结果可知，阴性组与正常组比较，阴性组中的MDA含量剧增，较正常组存在极显著性差异(p<0.01)；联苯双酯组与阴性组比较，MDA含量降低存在极显著性差异(p<0.05)，说明联苯双酯滴丸起到了保护和治疗效果，PLD-NSe0组随着剂量的增加，MDA含量降低，且PLD-NSe0高剂量组较联苯双酯组无显著性差异，说明PLD-NSe0也具有保护肝脏的作用，且效果与剂量成正比。

表3小鼠肝组织中MDA的含量和GSH-Px活力值

MDAGSH-Px 正常组7.00±1.86241.27±45.99阴性对照组12.27±2.49∗163.47±24.45∗阳性对照组8.54±1.36 ♦232.10±58.70♦多糖高剂量组8.82±2.20220.80±42.37#多糖中剂量组9.22±1.05 196.11±34.20♦#多糖低剂量组10.95±1.54∗☉169.98±47.26∗^

注：与正常组比较，*：p<0.01 ；与阴性组比较，◆：p<0.01；与阳性组比较，☉：p<0.01

3.5 PLD-NSe0对肝组织中GSH-Px活力的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是生物体内广泛存在的一种过氧化物分解酶，其活力降低会使机体抗氧化能力下降，由表3中GSH-Px活力值可看出，阴性组与正常组比较，阴性组较正常组GSH-Px活性降低，并存在极显著性差异(p<0.01)，说明造模成功；PLD-NSe0治疗组与阴性组比较，PLD-NSe0治疗组均可使GSH-Px活性升高，且PLD-NSe0高、中剂量组与阴性组存在显著性差异(p<0.05)，推测PLD-NSe0可增强GSH-Px的活力，修复损伤的肝细胞，起到保肝作用。

3.6 肝组织病理学结果

图4为肝组织HE的染色结果。由图4可以看出，正常组小鼠肝组织结构清楚，细胞排列整齐，边界明显，肝组织细胞没有水肿、玻璃样变性等；模型组肝组织细胞形态模糊，组织细胞有明显的气球样变性和玻璃样变性，且嗜伊红增强，说明肝细胞损伤严重；联苯双酯组肝细胞水肿减轻，嗜伊红现象减弱，肝细胞排列较为整齐，形态较为清晰；PLD-NSe0低剂量组较模型组嗜伊红面积减小，水肿现象减轻；PLD-NSe0高剂量组和中剂量组相对于阴性组而言嗜伊红面积和玻璃样变组织细胞均明显减少，细胞核明显，形态清晰，几乎没有细胞水肿，与联苯双酯组基本相近，表明PLD-NSe0高、中剂量有很好的保护肝组织和修复肝细胞损伤的作用。

图2 肝组织HE染色结果(HE染色，×200)

4 结 论

PLD-NSe0能够降低由CCl4所致的急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、ALP水平和GLB含量，升高TP、ALB含量，并能够使肝组织中GSH-Px活力增强，MDA含量降低。证明PLD-NSe0对急性肝损伤有一定治疗注作用，且治疗效果高剂量组>中剂量组>低剂量组，高剂量组与阳性相对照组治疗效果经数据统计分析无显著差异，即疗效相当。可为PLD-NSe0药用价值的进一步开发和综合利用奠定理论基础，并为临床防治肝病用药的开发提供基础数据。