茶皂素对甘薯小象甲的行为及生长发育的影响

2019-08-08潘如军唐秀桦何龙飞任立云

西南农业学报 2019年7期

潘如军，唐秀桦，何龙飞，任立云*

(1.广西大学农学院植物科学国家级实验教学示范中心，广西南宁 530004；2.广西农业科学院经济作物研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】甘薯小象甲(Cylasformicarius)，又名甘薯蚁象，在全球热带及亚热带甘薯种植区普遍发生，在我国广泛分布于南方产区，是国内外进出口检疫的重要害虫[1]。甘薯小象甲除成虫咬食薯藤、叶、幼芽及薯块外，其幼虫还蛀食粗蔓和薯块，在薯块内部形成隧道，受蛀食部位被诱导产生萜类和酚类等物质[2-3]，使味道苦涩，品质下降，以至于不能食用或饲用。该虫每年发生6～8代，存在世代重叠现象[4]。发生该虫的大多数疫区薯块为害率高达60 %～100 %[5]，而因此造成的甘薯产量损失达5 %～20 %，严重地区达30 %以上[6]。茶皂素(Tea saponin)是一种五环三萜类皂苷物质[7]，又称作茶皂甙、皂甙、皂角甙，是性能优良的新型天然非离子表面活性剂[8]，在山茶科(Theacease)山茶属(Camellia)植物中含量非常丰富[9]。因具有高效的发泡、乳化、分散、润湿等作用[10]，同时还具有直接的杀虫活性，茶皂素的应用领域拓展到了农药行业。研究茶皂素对甘薯小象甲的防治作用，对甘薯产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前已登记的30 %茶皂素水剂实际防治效果良好，对茶小绿叶蝉(EmpoascapirisugaMatumura)的防治在喷药后7d的平均防效高达90.05 %[11]；陈充等[12]在对甘蓝菜青虫(Plutellaxylostella)的田间防治中，每0.067 hm2施用233 mL的30 %茶皂素水剂的总体防效达89.86 %，并且对比每0.067 hm2施用80 mL的48 %毒死蜱乳油无显著差异；此外，30 %茶皂素水剂对尺蛾卵还有极强的毒杀作用，对其幼虫有较强的忌避和拒食作用[13]。【本研究切入点】虽然已有多项试验证实茶皂素具有杀虫活性，但尚未明确其对甘薯小象甲是否具有抑制作用。【拟解决的关键问题】对甘薯小象甲在茶皂素作用下的嗅觉趋向及取食行为进行生物学测定，并采用人工饲料法测定茶皂素对该虫发育历期以及生存情况的影响，挖掘茶皂素的应用潜力，为甘薯小象甲茶皂素类杀虫剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

茶皂素粉剂(纯度≥98 %)，用电子天平(SartoriusBSA224S-CW，德国赛多利斯集团)称取20.0 g茶皂素粉剂，加入100.0 mL蒸馏水配置成20.0 %(g/v)的茶皂素水溶液，再依次稀释为10.0 %、5.0 %、1.0 %、0.5 %(g/v)的茶皂素水溶液，备用。

甘薯品种为海南鸡蛋黄，购自广西南宁市大康惠超市，带回实验室用清水冲洗干净后晾干备用。

甘薯小象甲采自广西大学农场甘薯田，置于人工气候箱(RPX-250C，上海福玛实验设备有限公司)中，在(28±1)℃、65 %±3 %RH条件下用甘薯繁殖2～3代，取羽化5～8 d的甘薯小象甲成虫用于试验。

人工饲料配方[14]：抗坏血酸(1.8 g)、豆甾醇(720.0 mg)、对羟基苯甲酸甲酯(675.0 mg)、山梨酸钾(675.0 mg)、酵母膏(9.0 g)、氯化胆碱(450.0 mg)、琼脂粉(40.0 g)、混合维生素B(45.0 mg)、纤维素(14.4 g)、肌醇(360.0 mg)、混合盐(2.7 g)、葡萄糖(40.0 g)、干酪素(21.6 g)、无水乙醇(20.0 mL)、盐酸四环素(200.0 mg)、蒸馏水(900.0 mL)、甘薯粉(80.0 g)，其中甘薯粉为新鲜甘薯切片烘干(60 ℃，4 h)后打成粉末制成。

人工饲料配制方法：在蒸馏水加入琼脂粉并煮沸，再冷却至55 ℃；加入甘薯粉、葡萄糖、干酪素、纤维素、混合盐、酵母膏和抗坏血酸，充分搅拌2 min以上。将混合维生素B、氯化胆碱、肌醇、豆甾醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸钾及盐酸四环素(含0.5 %和1.0 %茶皂素的处理组中还需分别加入4.6 g和9.2 g的茶皂素粉末)加入无水乙醇中搅拌至溶解，再加入琼脂混合物混合搅拌2 min以上，最后把配制好的人工饲料装入培养管(有透气孔的0.5 mL离心管)中，冷却待用。

1.2 甘薯小象甲对茶皂素嗅觉趋向的测定

Y型嗅觉仪的连接顺序：将干燥塔(高32.0 cm，直径4.0 cm)依次连接玻璃转子流量计(LZB-3，常州鑫旺仪表有限公司；空气 20 ℃ 101.3 kPa l/min)、样品瓶(高10.0 cm，直径6.5 cm)、Y型管(叉管长15.0 cm，底管长13.0 cm，管径3.0 cm)、抽气泵(真空泵VLC6503-24V、调速器TAA02-24V，成都气海机电制造有限公司)。打开抽气泵电源，将流量计流量调至0.8L/min，嗅觉仪系统连续抽气10 min，使系统内流量稳定至规定值。

分别量取3.0 mL系列浓度为0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液，按浓度由低到高的顺序依次放入样品瓶，每个浓度作为1个处理，在对照瓶中放入同样体积的清水作为对照。试验在室内遮光环境[T：(27±2)℃，RH：65 %±5 %]下进行，选取10头健康的甘薯小象甲成虫从Y型管的直臂端引入，打开抽气泵电源等待气流稳定后开始试验，10 min后分别观察和记录处理臂与对照臂甘薯小象甲的数量，重复6次。

1.3 甘薯小象甲对茶皂素取食选择的测定

采用选择性测定法。用打孔器得到圆柱形(长3.0 cm，直径1.5 cm)薯块分别浸于系列浓度为0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液中，20 s后取出晾干，放入培养皿(直径7.5 cm)的一侧，以同样大小的薯块浸渍清水后取出晾干放入同一培养皿的另一侧作为对照，然后分别接入已饥饿4 h的甘薯小象甲成虫10头，置于培养箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中，分别于1和6 h后记录处理薯块和对照薯块上的甘薯小象甲数量，重复6次。

1.4 茶皂素对甘薯小象甲茶的拒食作用测定

采用非选择性测定法。用打孔器得到圆柱形(长3.0 cm，直径1.5 cm)薯块分别浸于系列浓度为0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液中，20 s后取出晾干，放入培养皿(直径7.5 cm)中，每皿放薯块1块，然后分别接入已饥饿4 h的甘薯小象甲成虫10头，置于培养箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中饲养；将同样大小的薯块浸入清水中，20s后取出晾干，放入同样规格的培养皿中作为对照。12、24、48及72 h后分别记录处理薯块和对照薯块上的取食孔数量，重复6次。

1.5 茶皂素对甘薯小象甲幼虫发育历期和死亡率的影响

将40头雌虫和10头雄虫放入含有未被甘薯小象甲侵染的甘薯块的培养瓶(高9.0 cm，直径9.0 cm)中，任其交配与产卵；2 d后取出甘薯及其表皮下的虫卵，分别转移至装含0.5 %、1.0 %茶皂素和不含茶皂素的人工饲料的培养管(0.5 mL离心管)中，每管接入1粒卵(用针头在饲料基质表面戳出小孔，将卵嵌入其中)，逐一对培养管编号，置于培养箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中培养，接卵后每天逐一观察培养管中甘薯小象甲各虫期的发育情况，记录卵、幼虫和蛹的发育历期及死亡数量。每个处理20管(1头虫/管)，重复3次，共180管。

1.6 统计分析

数据均以“平均数±标准误(SE)”表示，采用SPSS20.0软件分析。采用单因素方差分析和Duncan多重比较法检验数据显著性。采用生存函数寿命表对试虫幼体生存情况进行分析。

拒食率(%)=

校正死亡率(%)=

2 结果与分析

2.1 茶皂素对甘薯小象甲嗅觉趋向的影响

由表1可知，0.5 %茶皂素的嗅觉忌避率为0.00 %，处理臂虫数与对照臂虫数之间差异不显著(P>0.05，下同)，表明该浓度茶皂素对甘薯小象甲未产生显著影响；1.0 %、5.0 %和10.0 %茶皂素的嗅觉忌避率都为负值，表明以上浓度的茶皂素对甘薯小象甲具有引诱作用，但处理臂虫数与对照臂虫数之间差异不显著；20.0 %茶皂素的嗅觉忌避率为9.14 %，但处理臂虫数也与对照臂虫数之间差异不显著，表明该浓度茶皂素对甘薯小象甲具有嗅觉忌避作用，但十分有限。由此可见，茶皂素对甘薯小象甲不具有明显嗅觉忌避作用和引诱作用。

2.2 茶皂素对甘薯小象甲取食的忌避作用

由表2可知，茶皂素对甘薯小象甲具有取食忌避作用，且随着茶皂素浓度增大作用增强；1 h时，0.5 %和1 %茶皂素的取食忌避作用较低，5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的取食忌避率较高，分别为59.88 %、80.00 %和86.67 %，3个处理组虫数与对照组虫数之间差异显著(P<0.05，下同)；6 h时各浓度茶皂素对甘薯小象甲的取食忌避作用相对于1h都更明显，并随着茶皂素浓度增大而增强，0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的取食忌避作用都较强，取食忌避率分别为58.14 %、77.77 %、88.23 %、95.00 %和97.65 %，且各处理组虫数与对照组虫数之间均存在显著差异。

表1 甘薯小象甲对茶皂素产生的嗅觉忌避率

注：表中数值以平均值±标准误表示。

Note: Data in the table is mean values ±SE.

表2 茶皂素对甘薯小象甲的取食忌避率

注：表中数值以平均值±标准误表示，*表示处理组与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。

Note：Data in the table is mean values ±SE. *indicates significant differences between treatment groups and control groups atP<0.05.

2.3 茶皂素对甘薯小象甲的拒食作用

各浓度茶皂素对甘薯小象甲都具有拒食作用，但未发现具有急性毒性。由表3可知，12h时0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率为36.26 %和37.50 %，其取食孔数与对照组之间差异显著；5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率为85.00 %、81.25 %和92.50 %，其取食孔数与对照组之间差异显著。24 h时甘薯小象甲对0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率为56.55 %和62.50 %，其取食孔数与对照组之间差异显著；对5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率为85.00 %、81.25 %和92.50 %，其取食孔数与对照组之间差异显著。48 h时甘薯小象甲对0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率为66.95 %和66.27 %，其取食孔数与对照组之间差异显著；对5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率为96.39 %、95.48 %和98.19 %，其取食孔数与对照组之间差异显著。72 h时甘薯小象甲对0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率为63.01 %和67.54 %，其取食孔数与对照组之间差异显著；对5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率为97.14 %、96.42 %和98.57 %，其取食孔数与对照组之间差异显著。

由图1可见，甘薯小象甲对各浓度茶皂素拒食率随时间推移都呈逐渐增长趋势，其中，对0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率在24～72 h内趋于平稳，拒食率为56.55 %～67.54 %，与其他3个浓度相比，拒食率数值保持在居中水平，这意味着甘薯小象甲对0.5 %和1.0 %茶皂素的进食与拒食相对平衡，此时可以保证甘薯小象甲可以最大程度地将茶皂素摄入体内，这有助于开展关于茶皂素对甘薯小象甲长期影响的研究。

表3 茶皂素对甘薯小象甲的拒食率

注：表中数值以平均值±标准误表示，同列中数字后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Data in the table is mean values ±SE，mean values within a column with different letters are significantly different atP<0.05.

表4 茶皂素影响下甘薯小象甲的幼体历期及死亡率

注：表中数值以平均值±标准误表示，*表示处理组与对照组之间经t-检验存在显著差异(P<0.05)。

Note：Data in the table is mean values±SE. *indicate significant differences between treatment group and control group atP<0.05.

2.4 茶皂素对甘薯小象甲卵、幼虫及蛹阶段历期及生存的影响

由表4可知，甘薯小象甲的卵、幼虫和蛹历期随茶皂素浓度的升高而不断缩短，且幼体发生死亡，幼虫期死亡率最高。0.5 %茶皂素影响下的卵历期为7.29 d，较对照组缩短了1.44 d，差异显著；1.0 %茶皂素影响下的卵历期为6.90 d，较对照组缩短了1.83 d，差异显著。0.5 %茶皂素影响下的幼虫历期为22.88 d，较对照组缩短了0.62d，差异显著，校正死亡率为13.30 %；1.0 %茶皂素影响下的幼虫历期为22.07 d，较对照组缩短了1.43 d，差异显著，其死亡虫数与对照组和0.5 %茶皂素组的差异显著，校正死亡率为53.33 %。0.5 %茶皂素影响下的蛹历期为6.44 d，较对照组缩短了0.68 d，差异显著，其死亡虫数与对照组和0.5 %茶皂素组的差异显著；1.0 %茶皂素影响下的幼虫历期为5.69 d，较对照组缩短了0.75 d，差异显著，较0.5 %茶皂素组缩短了0.07 d，其死亡虫数与对照组的差异显著。

图1 不同时间内各浓度茶皂素对甘薯小象甲的拒食率趋势Fig.1 Trend of antifeedant rate of tea saponin in different concentrations to C. formicariusin different time

由生存曲线(图2)趋势可知，茶皂素对甘薯小象卵孵化期及幼虫后期至化蛹期的生存影响较大，随浓度的增大其影响作用也更明显，在羽化后的试虫中，CK的存活率为42.00 %，0.5 %和1.0 %茶皂素处理的存活率分别为35.00 %和22.00 %。

3 讨论

本研究中，茶皂素水溶液对甘薯小象甲既没有嗅觉忌避作用，也没有嗅觉引诱作用，可能是由于茶皂素在常温下是一种难以挥发的物质[15]，其飘散在空气中的成分极少，不足以引起甘薯小象甲强烈的行为趋向，这有待进一步验证。而茶皂素对甘薯小象甲具有明显的取食忌避作用，忌避率随茶皂素浓度升高而升高，随时间增长而升高；饲喂6 h的试虫忌避行为比1 h的试虫更显著，可见在更长的饲喂时间下甘薯小象甲对茶皂素更为敏感。相对于1 h时处于饥饿的状态下的试虫，6 h时的非饥饿状态下的试虫会对食物进行更优的选择，因此对含茶皂素食物的选择也相应减少。此外，茶皂素对甘薯小象甲具有强烈的拒食作用，拒食率随时间增长而升高，不具有急性毒性。这同样表现在对菜青虫拒食活性上，Cai等[16]采用叶牒饲喂法用500 mg/L茶皂素水溶液处理的芥蓝叶牒饲喂5龄菜青虫幼虫，12 h后选择性拒食率可达100 %，采用灌根寄主植物的方法，24 h后菜青虫的拒食率达63.95 %。在茶皂素影响下甘薯小象甲的幼体发育历期缩短，猜测茶皂素可能具有抗保幼激素活性。本研究中，茶皂素虽然没有对甘薯小象甲的卵造成显著伤害，但极大地缩短了卵的发育时间，这可能是由于茶皂素的早熟作用促进了胚胎发育。当进入甘薯小象甲进入幼虫阶段后，出现了59.22 %的死亡率，可能原因为：①早熟胚胎孵化不健康的幼虫导致快速死亡；②抗性较强的幼虫在摄入茶皂素后，引起的早熟作用使幼虫出现不正常发育，导致提前转龄和化蛹，或出现蜕皮障碍导致死亡。当进入蛹阶段后，虽然甘薯小象甲在这一时期的抗逆性较强，但幼虫时期产生的影响导致了蛹滞育，从而死亡。这种类昆虫激素的抗虫作用方式在常规试验中很难被发现，但不能排除其存在的可能性，且植物源药剂的优势就在于其作用方式多样化，其中潜在的抗虫作用方式应受到重视。有报道称，茶皂素使小菜蛾蛹的发育历期个体显著延长[17]，也有研究表明茶皂素对茶尺蠖(Ectropisobliqua)3龄幼虫、小菜蛾(Plutellaxylostella)2龄幼虫、豆蚜(Aphiscraccivora)[18]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)4龄和5龄幼虫[19]具有较强的毒杀活性，这些结果与本试验结果相似，验证了茶皂素的抗虫活性，下一步可对其作用机理开展深入研究。