HBO1表达水平在结直肠癌预后判断中的价值

姚佳圆，李建生，李东颖

郑州大学第一附属医院消化内科，河南 郑州 450052

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，据最新统计,CRC在全球范围内所有恶性肿瘤中的发病率居第四位，死亡率居第二位，中国近十年来CRC发病率和死亡率也均呈明显上升趋势[1]。根据2015年中国癌症统计数据预估我国每年CRC新发和死亡患者数分别约为37.63万例和19.1万例，排在恶性肿瘤第5位[2]。因CRC早期临床症状不典型，大多数患者就诊时已处于中晚期阶段，而中晚期CRC的治疗效果较差，预后不佳。因此，寻找早期诊断和判断预后的标志物，识别预后欠佳的患者，在指导治疗和改善预后方面具有重要意义。多项研究表明[3-5]，血清癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)在CRC患者中高表达，其表达水平升高与CRC患者发生转移、生存期短有关，作为肿瘤标志物已广泛用于CRC患者筛查、辅助诊断和预后评估，并作为CRC患者术后复发或转移的监测指标。

HBO1即组蛋白乙酰转移酶(HAT)结合起始识别复合物1(ORC1)，是组蛋白乙酰转移酶MYST家族的一员[6]，含611个氨基酸，定位于人类17号染色体长臂2区1带第3亚带区域(17q21.3)，是组蛋白特异乙酰转移酶，最初被鉴定为ORC1结合蛋白在复制前复合物(pre-RC)中充当辅因子[7]。乙酰化是最早认识到的组蛋白修饰类型，在基因特异性转录调控和DNA复制及损伤修复中起到重要作用。HBO1主要负责组蛋白H3、H4的乙酰化，即是组蛋白赖氨酸残基N末端区域的共价修饰，调控染色质结构，在真核生物DNA调控和基因表达中起重要作用[8]。此外，HBO1也可以对一些非组蛋白因子如ORC2、MCM2、CDC6等发挥乙酰转移酶活性作用[9]，在促进生长关键基因表达和胚胎发育方面有重要作用。最近研究[10-12]报道，HBO1在多种肿瘤组织中高表达，如食管癌、肝癌、睾丸癌、骨肉瘤、乳腺癌和卵巢癌等，且HBO1高表达与患者预后相关。

但HBO1在CRC中的研究甚少，本研究通过检测HBO1在CRC组织和癌旁正常组织中的表达水平，分析其与CRC患者临床病理特征及预后的关系，进而为CRC的研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料以郑州大学第一附属医院2012年1月至2013年8月收治的135例CRC患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织为研究对象，男70例，女65例，年龄(57.89±12.35)岁(23～91岁)，所有入选患者手术前均未进行治疗。术中留取癌组织和癌旁正常组织标本，所有标本经液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存备用。所有组织切片由专业的病理医师进行组织病理学诊断，根据AJCC第八版对CRC进行TNM分期。所有入选患者均有完整的临床资料及随访记录，随访截至2018年8月。本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂鼠抗人HBO1购自Abcam公司，HRP标记山羊抗鼠IgG购自Sigma公司。免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，qRT-PCR试剂盒购自大连Takara公司。

1.3 HBO1 mRAN检测将癌组织和癌旁正常组织进行研磨，用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，以β-actin为内参基因。设计目标基因和内参基因的引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，检测结果用内参基因β-actin进行标准化。引物序列如下：HBO1上游引物5′-TTTTGGCCGCTATGAACTG-3′，下游引物5′-GGAGGATTGTCTGGCTCTTC-3′，产物大小为755 bp。内参基因β-actin上游引物5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3′，下游引物5′-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3′，产物大小为336 bp。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min、94 ℃ 40 s、57 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，40次循环，72 ℃ 10 min。分析实时记录PCR反应的Ct值，采用2-△△Ct表示HBO1 mRNA的表达量，实验重复3次，结果取平均值。

1.4 HBO1蛋白免疫组化检测及评估标准取CRC组织和癌旁正常组织经过处理(固定、脱水、包埋等)制成切片，行免疫组织化学染色后，将切片置于高倍显微镜下观察HBO1的表达情况。HBO1定位于细胞核中，染色后呈棕黄色或棕褐色颗粒，随机取5个高倍视野计数细胞100个，按照染色强度及细胞阳性率进行评分。染色强度：0分(未着色)，1分(浅黄色)，2分(黄棕色)，3分(棕褐色)；细胞阳性率：1分(<10%)，2分(11%～50%)，3分(51%～80%)，4分(>80%)。两项得分相乘为结果：0～4分表示低表达，6～12分表示高表达。

2 结果

2.1 HBO1 mRNA表达量、蛋白表达水平在CRC组织和癌旁正常组织中的表达比较CRC组织和癌旁正常组织HBO1 mRNA表达量分别为2.09±0.62和0.57±0.16，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。标本经免疫组化染色后显示HBO1定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在CRC组织中的表达高于癌旁正常组织(见图1)。135例CRC患者癌组织中HBO1蛋白高表达例数为87例(64.4%)，癌旁正常组织中HBO1蛋白高表达例数为19例(14.1%)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.001)。

图1 CRC组织和癌旁正常组织中HBO1蛋白的表达(免疫组化染色，200×) A：CRC组织；B：癌旁正常组织Fig 1 Expression of HBO1 protoin in CRC tissues and adjacent non-tumor tissues (immunohistochemical staining, 200×) A: CRC tissues；B: adjacent non-tumor tissues

2.2 HBO1蛋白表达水平与CRC患者临床病理因素的关系如表1所示，HBO1表达水平与肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、术前血清CEA及血清CA19-9水平相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄和组织类型无关 (P>0.05)。表明HBO1蛋白表达水平随着临床分期增加而上调，HBO1高表达可能促进CRC的进展和转移。

表1 HBO1表达与CRC临床病理因素的关系 Tab 1 Relationship between HBO1 expression and CRC clinicopathological factors 比例/%

续表1

临床特征例数低表达高表达χ2值P值 N2254(16.0)21(84.0)远处转移-0.042 无12848(37.5)80(62.5) 有707(100)CEA15.0180.000 ≤5 ng/ml8340(48.2)43(51.8) >5 ng/ml528(13.5)44(86.5)CA19-94.5450.033 ≤35 U/ml11144(39.6)67(60.4) >35 U/ml244(16.7)20(83.3)

2.3 HBO1表达与CRC患者预后的关系所有患者术后随访时间为(44.62±15.41)个月，5年总体生存率为49.6%。HBO1高表达组较低表达组患者5年总体生存率显著降低(35.5%vs67.7%，P<0.05，见图2)。单因素分析显示，肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、HBO1表达水平、术前血清CEA及CA19-9水平与患者预后有关(P<0.05)。多因素分析显示，分化程度、TNM分期、HBO1表达水平是CRC患者预后的独立影响因素(见表2)。

表2 单因素和多因素分析结果Tab 2 The results of univariate analysis and multivariate Logistic regression analysis

图2 HBO1高表达组和低表达组的生存曲线Fig 2 Survival curve of HBO1 high expression group and low expression group

3 讨论

CRC是全球第二大死亡率恶性肿瘤，严重危害人类健康，对于中晚期CRC患者仍缺乏有效治疗，早期诊断和准确判断预后是近年来研究的重点。

HBO1是MYST家族中重要一员，在协调基因转录和DNA复制方面具有重要作用，已有研究[13-17]证实，HBO1高表达导致过度的基因复制、转录和细胞增殖，从而导致各种肿瘤的发生。CHEN等[18]研究发现，膀胱癌组织中HBO1表达上调，通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进膀胱癌细胞增殖，HBO1高表达与肿瘤分期、肿瘤大小及膀胱癌患者预后明显相关，HBO1高表达的患者预后不良且生存期较短。WANG等[19]研究发现，HBO1在乳腺癌组织中高表达，且与雌激素受体α阳性肿瘤的组织学分级呈正相关，HBO1高表达发挥致癌作用。DUONG等[10]还发现，HBO1促进乳腺癌干细胞样细胞的富集。IIZUKA等[20]进一步研究发现，在乳腺癌中HBO1高表达导致雌激素受体α失去稳定性并促进乳腺癌肿瘤细胞的增殖。QUINTELA等[21]研究发现，HBO1在原发性卵巢癌中过表达，与肿瘤复发转移相关。SONG等[11]在胰腺癌化疗耐药的研究中发现，与对照组相比，吉西他滨耐药组的HBO1表达明显升高，说明HBO1高表达促进了胰腺癌的化学耐药性。CAI等[22]在肝细胞癌研究中发现，HBO1募集到整合素基因启动子并乙酰化组蛋白从而激活转录，HBO1高表达与肝细胞癌转移相关，常提示预后不良。肿瘤细胞中常表现出高比率的有氧糖酵解，有研究[23]表明，转录因子通过HBO1过表达介导组蛋白H4磷酸化促进糖酵解基因的转录，促进乳腺癌和肝细胞癌肿瘤细胞的生长。以上研究提示，肿瘤细胞中HBO1的高表达与肿瘤发生、耐药、转移和预后密切相关。

本研究通过对135例CRC患者癌组织的HBO1 mRNA相对表达量检测，较癌旁组织显著升高，经免疫组化检测发现癌组织中HBO1蛋白高表达，与CRC肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、HBO1表达水平、术前血清CEA及血清CA19-9水平相关。分化程度、TNM分期，HBO1表达水平是CRC患者预后的独立影响因素。

综上所述，HBO1在CRC组织中高表达，与CRC的发生、发展和患者的预后相关，具有作为CRC辅助诊断和预后判断标志物的潜能。然而，尚需进一步研究其在CRC中可能涉及的分子机制。