槟榔醇提物对H9C2心肌细胞的抗缺氧保护作用

赵安鹏，靳 婷,2，王 荣,2

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院全军高原损伤防治实地重点实验室，甘肃 兰州，730050;2.兰州大学药学院，甘肃 兰州，730000)

足够的氧气对于机体各部分的生存是至关重要的，对于具有高能量需求的组织(例如心脏)尤为重要。然而，急进高原时，低氧将是机体需要应对的最大挑战。心肌组织具有耗能、耗氧高的特点，处于低氧环境的心肌出现氧合不足，组织受损，心功能也会产生一定程度的障碍[1]。

氧化应激是引起细胞受损的重要原因之一，出现氧化应激时，细胞内生成大量具有毒性的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和自由基，而心肌细胞非常容易受ROS影响。低氧时，心肌细胞生成大量ROS及氧自由基，引起蛋白质变性、核酸链断裂及膜脂质的过氧化，其主要产物丙二醛(malondialdehyde，MDA)可以作为氧化应激损伤的重要检测指标。与此同时，心肌细胞内产生的抗氧化物及自由基清除剂也发挥着保护细胞免受损伤的作用，如过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)[2]。所以，抑制自由基的产生或促进内源性的抗氧化作用都能够减轻心肌细胞的损伤。

槟榔，棕榈科槟榔属植物，生物活性较为复杂[3-5]。本课题组的前期研究结果表明[6]，在常压密闭缺氧实验中，槟榔无水醇提物能够显著增加小鼠的生存时间；在模拟高原急性缺氧及急进高原实地缺氧实验中，其对大鼠具有显著的保护作用，但保护机制尚不明确。为了进一步探讨槟榔醇提物的心脏保护作用及机制，本研究将使用心肌H9C2细胞构建低氧损伤模型，通过检测细胞存活率，细胞内抗氧化酶活力的变化及低氧损伤相关基因的变化，研究槟榔无水醇提物对H9C2细胞损伤的保护作用，探讨相关机制。

1 材料与仪器

1.1 材料与试药

H9C2细胞株(编号：GNR 5，上海中科院细胞库)；高糖DMEM培养基、1×PBS溶液(美国，Hyclone)；胎牛血清(德国，PAN Biotech)；100×青霉素-链霉素混合液(美国，Gibco)；D-Hanks溶液、BCA蛋白测定试剂盒(北京，Solarbio)；Cell Counting Kit-8试剂盒(日本，Dojindo)；MDA试剂盒、SOD试剂盒、GSH试剂盒(南京建成)；RIPA强效蛋白裂解液(上海碧云天公司)；95%N2，5%CO2混合器(兰州苪康商贸有限公司)；TRIzol®Reagent、PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)、RNA-free Water、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(大连，TakaRa宝生物工程公司)；核因子相关因子E2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)引物，由TakaRa合成；没食子酸标准品(上海源叶生物科技有限公司)；槟榔由联勤保障部队第九四〇医院药剂科中药室提供，购自甘肃陇脉药材有限公司(批号160501)；槟榔提取物为联勤保障部队第九四〇医院高原损伤防治实地重点实验室制备；红景天胶囊(中国人民解放军西藏军区红景天研制中心，规格0.38 g)。

1.2 仪器

细胞培养箱(德国，Memmert)；细胞培养瓶(25 cm2，美国，Corning Costar)；Microfuge22R台式冷冻离心机(美国，Beckman)；倒置显微镜(日本，Olympus)；ABI7300实时荧光定量PCR仪(美国，Applied Biosystemes)；Modular Incubator Chamber模块化培养室(美国，Brincubator)；EST-10-02氧气检测仪(深圳希特森环保设备商行)；超微量紫外分光光度计(德国，IMPLEN)。

2 实验方法

2.1 槟榔无水醇提物的制备

取槟榔切片2 kg，粉碎后过100目筛，取粉末1 kg，加30倍物料体积的无水乙醇后置于回流提取浓缩机(50～60)℃ 4 h，得提取液[7]，将提取液泵入浓缩罐中浓缩至1L，再用旋转蒸发仪挥干乙醇，浓缩液用冷冻干燥机干燥，收集；加水溶解为3 mg/ml，加入AB-8型大孔吸附树脂，以60%乙醇洗脱并收集，(40～50)℃旋转蒸发，浓缩液放入冷冻干燥机干燥，得槟榔无水醇提物[8]。

2.2 总酚含量测定

2.2.1试剂的配制

称取硫酸亚铁1.00 g，酒石酸钾钠5.00 g，加蒸馏水溶解定容到1 L，得酒石酸亚铁溶液；称取磷酸氢二钠60.20 g，磷酸二氢钠5.00 g，加蒸馏水溶解定容到1 L，得磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)。

2.2.2标准曲线的制作

以酒石酸亚铁比色法测定总酚含量[7]，称取5 mg没食子酸标准品，加蒸馏水定容至10 ml，得0.5 mg/ml的对照品溶液，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml对照品溶液于5 ml容量瓶，蒸馏水补至1 ml，加入1 ml酒石酸亚铁溶液后以磷酸盐缓冲液(pH 7.5)定容至刻度，混匀后静置15 min，以蒸馏水作为空白参比，在540 nm波长处测定吸光度值(A)。

2.2.3槟榔无水醇提物总酚含量的测定

以60%乙醇为溶剂，配制1 mg/ml的槟榔无水醇提物溶液。取0.2 ml置于5 ml容量瓶，加蒸馏水至1 ml，加入1 ml酒石酸亚铁溶液，以磷酸盐缓冲液(pH 7.5)定容至刻度，混匀静置15 min后，以蒸馏水作为空白参比，在540 nm波长处测定其吸光度值(A)，平行测定3份。

2.3 H9C2心肌细胞的培养

将H9C2细胞以2×106个/瓶，接种于25 cm2细胞培养瓶(透气盖)中，放入细胞培养箱进行培养，条件为37℃，5% CO2，95% RH。等细胞融合度≥75%，进行传代，置于25 cm2细胞培养瓶(透气盖)中继续培养。

2.4 H9C2细胞低氧处理

选择对数生长期且状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化，离心，去上清，重悬，接种于细胞培养板中进行相应实验。常氧组置于细胞培养箱中正常培养。低氧组和给药组置于模块化培养室中，给予含有95%N2和5%CO2的二元气，使用氧探测仪检测培养小室中氧浓度为0%时停止送气，关闭阀门，将低氧装置置于细胞培养箱中培养。

2.5 CCK-8法检测槟榔醇提物对H9C2细胞存活率的影响

细胞消化、重悬后，吹散到单个细胞数量≥95%后，以10 000个/孔，接种于96孔板，每孔体积100 μl。分别为常氧对照组、低氧模型组、阳性对照红景天胶囊组、无水醇提物组，其中非给药组及给药组的各剂量组均做3个复孔。继续以正常条件培养24～48 h，待细胞融合度≥70%后，阳性对照组和无水醇提物组分别加入终浓度为5、10、20 μg/ml的含有红景天或槟榔醇提物的培养基溶液100μl。常氧对照组、低氧模型组加入100 μl/孔的完全培养基。低氧处理24 h、48 h后，吸弃原培养液，用等体积的新鲜培养基清洗细胞2次后，重新加入100μl培养基及10 μl CCK-8液，37℃孵育1 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

2.6 槟榔无水醇提物对低氧H9C2细胞内氧化应激指标的影响

把H9C2细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞融合度≥70%后各组分别加入终浓度为20 μg/ml的红景天或无水醇提物的含药培养基1.5 ml。低氧处理24 h，吸弃原培养基，用预冷的PBS液清洗3次，每孔加入400 μl RIPA强效蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF 4 μl)，冰上裂解、破碎后吸取上清，严格依照说明书测定相关指标。

2.7 槟榔无水醇提物对低氧H9C2细胞内Nrf2、Caspase3基因mRNA的影响

用Trizol法提取细胞内总RNA，参考TakaRa公司PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒的操作说明书进行逆转录cDNA合成。按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒的操作说明书，按表1所示配制反应体系，在ViiATM 7 DX实时定量荧光PCR仪(Applied Biosystems)上进行PCR 扩增反应。采用2-△△CT方法计算定量PCR的数值进而比较正常对照组与高海拔缺氧组中药物转运体的基因表达变化。

表1 Real-Time PCR反应体系

2.8 引物设计与合成

采用Primer 6.0合成引物，并在NCBI官网进行验证以保证引物设计正确。引物合成由Takara公司完成，如表2所示。

表2 基因引物序列

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 槟榔无水醇提物中的总酚含量

以对照品浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得对照品线性回归方程为Y=15.46X-0.004，r=0.9999，表明没食子酸在0.01～0.05 mg/ml范围内线性关系良好。根据线性回归方程，计算得出槟榔无水醇提物中总酚含量为(41.32±2.61)%。

3.2 不同低氧时间对细胞存活率的影响

实验结果如图1所示，细胞存活率随低氧时间的增加而减小。与常氧组相比，低氧24 h时细胞存活为28.46%(P<0.01)，低氧48 h时细胞存活为16.08%(P<0.01)。而低氧48 h与低氧24 h两组之间进行比较，细胞存活率无显著性差异(P>0.05)。所以选择低氧24 h作为低氧时间进行后续试验。

图1 不同低氧时间对细胞存活率的影响 *P<0.05，**P<0.01，与常氧组比较

3.3 不同浓度槟榔无水醇提物对H9C2细胞存活率的影响

由表3可知，与低氧模型组相比，终浓度为5、10、20 μg/ml的槟榔无水醇提物能显著增加低氧时H9C2细胞的存活率(P<0.01)，细胞存活率分别为38.97%、40.77%、51.65%，与同剂量的红景天相比，保护作用优于红景天。20 μg/ml给药时对低氧细胞保护作用最明显，所以后续试验中选择20 μg/ml给药。

表3 槟榔无水醇提物对细胞存活率的影响

**P<0.01与常氧空白组比较；#P<0.05,##P<0.01与低氧模型组比较；△P<0.05,与红景天组比较

3.4 槟榔无水醇提物对低氧H9C2细胞内氧化应激指标的影响

实验结果如表4，与常氧对照组相比，低氧模型组细胞内丙二醛含量增加了44.33%(P<0.05)，SOD、GSH活力分别下降16.18%、30.64%(P<0.05或P<0.01)，给予浓度为20 μg/ml无水醇提物处理后，SOD、GSH活力分别增加14.90%、28.94%(P<0.05)。无水醇提物处理组细胞内MDA含量，SOD、GSH活力与红景天处理组无显著性差异，无水醇提物与红景天作用无显著性差异。

表4 槟榔无水醇提物对细胞内MDA含量、SOD活力、GSH活力的影响

*P<0.05,**P<0.01与常氧空白组比较；#P<0.05,与低氧模型组比较

3.5 槟榔无水醇提物对低氧H9C2细胞内Nrf2、Caspase3基因mRNA的影响

实验结果如图2所示，与常氧组相比，低氧组细胞内Nrf2基因mRNA相对表达量升高1.74倍(P<0.05)。与低氧模型组相比，无水醇提物处理组细胞内Nrf2基因mRNA相对表达量降低66%(P<0.05)，作用与红景天无显著性差异。

图2 槟榔无水醇提物对H9C2细胞内Nrf2、Caspase3基因mRNA相对表达量的影响 * P<0.05与常氧空白组比较；#P<0.05与低氧模型组比较

4 讨论

本研究建立了H9C2细胞体外低氧模型，探究了槟榔无水醇提物对低氧受损H9C2细胞的保护作用，初步阐明其对细胞的保护机制。

在正常情况下，生物体由于细胞代谢而产生活性氧簇(reactive oxygen species ,ROS)，ROS水平的稳态是细胞维持正常形态及功能所必需的。相反，ROS的过量产生将导致细胞基本组成的受损，如DNA、蛋白质和脂质。当自由基的生成量超过了细胞的抗氧化能力时，氧化剂与抗氧化剂比例失衡，细胞发生氧化应激，这也是低氧时组织损伤的最常见原因。Nrf2是近年发现的参与氧化还原平衡调节的重要因子之一，在细胞内源性保护系统中具有重要作用，同时，其对细胞内部氧化还原稳态的改变极为敏感。当机体受到自由基或化学物质等刺激产生氧化应激时，Nrf2被激活，活化的Nrf2迁移入核后与抗氧化反应元件(ARE)结合，发挥调节细胞氧化还原稳态的作用[9-10]。本研究结果显示低氧细胞内Nrf2基因mRNA表达较常氧组增高，提示低氧导致细胞受到氧化应激刺激，相应的Nrf2被激活。与低氧组相比，无水醇提物处理后细胞内Nrf2基因mRNA表达下调，与常氧对照组趋于一致。虽然提高Nrf2的表达有助于细胞内抗氧化物的转录与表达，但我们认为Nrf2的升高也是细胞氧化应激程度的指针，槟榔无水醇提物降低了低氧细胞内Nrf2的mRNA水平可能与其改善细胞的氧化应激状态有关，相应的降低了Nrf2的应答。其减轻氧化应激的原因可能与增加细胞耐低氧能力，增强细胞内抗氧化酶活性，清除氧自由基等有关。Nrf2信号通路中包含多种蛋白激酶，为了更好的阐明槟榔无水醇提物的抗氧化应激机制，还需要对这些关键的蛋白进行相关的检测，我们将在后期对其进行深入研究。

此外，氧化应激也是诱导心肌细胞凋亡的常见诱因之一。细胞内ROS的异常积累可能导致细胞重要大分子的有害修饰，这些损害累积最终可能通过不同途径引起细胞凋亡。因此，调节细胞内的ROS可能是减少病理性细胞凋亡的有效方式[11]。Caspase家族在调节细胞凋亡的过程中发挥关键作用，可被多种刺激诱导，其中包括氧化应激。Caspase-3是凋亡的关键执行者，参与DNA降解，染色质的调控因子冷凝和核碎裂[12]。本研究结果表明，低氧刺激使Caspase-3 在转录水平有升高趋势，而槟榔无水醇提物处理能降低Caspase-3 mRNA 水平，这可能是其提高低氧情况下H9C2心肌细胞存活率的原因之一。更加深入的研究还有待于细胞凋亡的直接检测以及细胞内促凋亡/抗凋亡蛋白的相关研究等。

综上所述，槟榔无水醇提物对低氧H9C2细胞有明显的保护作用，其能提高细胞内抗氧化酶活性，具有使细胞免受氧化应激损伤的作用。