血清miR-297a、FGF23水平与高血压患者冠状动脉钙化的相关性研究

冯纪讷 陈雪 赵倩倩 王键

1.山东省临朐县人民医院心内科，山东临朐 262600；

2.潍坊市人民医院心内一科，山东潍坊 261000

冠状动脉钙化（Coronary artery calcification，CAC）是动脉粥样硬化的一种类型[1]。冠状动脉钙化程度高的患者其心血管相关事件的发生率高于冠脉钙化程度低的患者，并且钙化冠状动脉行介入治疗的难度远高于未钙化患者[2]。冠状动脉钙化的检测方法包括冠脉CT、冠状动脉造影、血管内超声等。

基础研究发现，钙化过程不是一个钙盐被动沉积过程，而是一个主动的生物学过程[3]。微小RNA（microRNA, miRNA)能够通过调控血管平滑肌细胞的表型而影响血管钙化的发生和发展，有研究表明冠状动脉钙化患者血清miR-297a表达异常[4]。成纤维细胞生长因子23（Fibroblast growth factor 23，FGF23）由成骨细胞分泌，具有调节钙磷平衡的功能，文献报道其与冠状动脉钙化密切相关[5]。

高龄、脂质代谢紊乱、高血糖、高钙血症、肾透析、高血压等是冠脉钙化的重要影响因素[6]。已有文献报道，维持性血液透析患者血清FGF23水平与冠状动脉钙化具有相关性[7]。本研究观察高血压人群miR-297a、FGF23表达水平及其与高血压冠状动脉钙化的相关性，分析miR-297a、FGF23作为冠状动脉钙化诊断标志物和治疗靶点应用于临床的可能性，为临床高血压患者冠状动脉钙化的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

入选标准：1）符合高血压诊断标准；2）未合并糖尿病、慢性肾病、恶性肿瘤；3）无高脂血症、高钙血症；4）签署知情同意书。排除标准：1）先天性心脏病或慢性风湿性心脏病；2）接受免疫抑制剂、糖皮质激素等药物治疗；3）接受活性维生素D冲击治疗。

选取2015年9月至2018年6月期间住院高血压患者95例作为研究对象，另选取同期在进行体检的40例无CAC健康者作为对照组。所有研究对象均完成血管内超声[8]。按照血管内超声结果，分为无钙化组、轻度钙化组（血管内超声I～II级）、重度钙化组（血管内超声III～IV级）。高血压无钙化组37例，轻度钙化组27例，重度钙化组31例。健康对照组及高血压无钙化组，轻度钙化组，重度钙化组4组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），研究具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有研究对象晨起空腹采取肘静脉血2mL，置于EP管内，4℃，3000 r/min离心10 min，小心吸取上清液置于另一EP管内，-80℃保存，现用现融，以免发生溶血。

1.2.2 qRT-PCR法检测血清miR-297a表达情况采用qRT-PCR法检测研究对象血清中miR-297a相对表达量。提取血清总RNA，按照试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，之后进行PCR检测。qRTPCR程序设定为：95 ℃预热30 s，60 ℃ 15 s，72℃ 15 s，以上三步骤共40个循环。以U6为内参，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-297a相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 FGF23及成骨细胞标记物 应用ELISA法检测血清中FGF23、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨形态发生蛋白2（Bone morphogenesis pale，BMP-2）、基质 Gla 蛋白（matrix gla protein，MGP）水平。试剂盒分别为人FGF-23 ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）、ALP检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、人BMP-2 ELISA试剂盒（艾美捷科技有限公司）、MGP检测试剂盒(酶联免疫吸附法)（上海钰博生物科技有限公司），严格按照操作说明书进行。

1.2.4 分析方法 比较4组血清miR-297a、FGF23、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、基质Gla蛋白水平，分析miR-297a、FGF23与碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、基质Gla蛋白的相关性。观察血清miR-297a和FGF23水平对高血压患者冠状动脉钙化的预测价值。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0对数据进行分析，计量资料符合正态分布的数据均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间采用方差分析；Pearson法进行相关性分析；采用Logistic回归分析法评估影响高血压患者冠状动脉钙化发生的因素；ROC曲线分析检测miR-197a和FGF23对高血压患者发生血管钙化的预测价值。各组数据均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 4组血清miR-297a、FGF23水平比较

高血压非钙化组miR-297a表达、FGF23水平与健康对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），轻度钙化组和重度钙化组miR-297a表达低于非钙化组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），轻度钙化组和重度钙化组FGF23水平高于非钙化组和健康对照组（P＜0.05）；与轻度钙化组相比，重度钙化组miR-297a表达降低，组间差异有统计学意义（P＜0.05），轻度钙化组与重度钙化组FGF23水平相比，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表2。

表2 4组miR-297a、FGF23水平比较 （±s）

表2 4组miR-297a、FGF23水平比较 （±s）

注：a代表与健康对照组相比，P＜0.05；b代表与非钙化组相比，P＜0.05；c代表与轻度钙化组相比，P＜0.05。

组别 例数 miR-297a/U6 FGF23（pg/mL）健康对照组 40 1.02±0.25 38.26±9.56非钙化组 37 1.04±0.24 37.95±9.48轻度钙化组 27 0.57±0.11ab 208.97±55.52ab重度钙化组 31 0.38±0.09abc 210.38±52.59ab F 155.381 444.568 P＜0.001 ＜0.001

2.2 4组冠状动脉钙化相关指标比较

轻度钙化组和重度钙化组的ALP、MGP高于非钙化组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。轻度钙化组、重度钙化组、非钙化组BMP-2高于健康对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。轻度钙化组和重度钙化组ALP、BNP-2、MGP组间差异无统计学意义（P＞0.05）。健康对照组与非钙化组ALP、MGP水平差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 4组ALP、BMP-2、MGP水平比较（±s）

表3 4组ALP、BMP-2、MGP水平比较（±s）

注：a代表与健康对照组相比，P＜0.05；b代表与非钙化组相比，P＜0.05。

组别 例数 ALP（U/gprot） BMP-2（pg/mL） MGP（pg/mL）健康对照组 40 49.86±14.12 13.59±3.51 89.72±22.43非钙化组 37 52.38±13.10 29.28±3.59a 91.05±21.76轻度钙化组 27 73.88±12.57ab 44.61±7.79a 58.87±19.33ab重度钙化组 31 83.64±28.41ab 42.38±11.05a 60.49±15.12ab F 148.839 243.647 34.681 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 血清miR-297a和FGF23水平与血管钙化相关指标相关性

Pearson相关性结果表明：miR-297a与ALP、BMP-2呈负相关（r= -0.759、-0.812，P＜0.05），与MGP呈正相关（r= 0.763，P＜0.05）；FGF23与ALP、BMP-2呈正相关（r= 0.759、0.804，P＜0.05），与MGP呈负相关（r= -0.811，P＜0.05）。详见表4。

表4 相关性分析

2.4 Logistic回归分析影响高血压患者冠状动脉钙化发生的因素

将是否发生冠状动脉钙化为因变量，以ALP、BMP-2、MGP、miR-297a和FGF23水平为自变量并进行Logistic回归分析，结果显示ALP、BMP-2、MGP、miR-297a和FGF23均为冠状动脉钙化的影响因素，miR-297高表达是影响血管钙化的保护因素，FGF23水平高是影响冠状动脉钙化的危险因素。详见表5。

表5 多元回归分析

2.5 血清miR-297a和FGF23水平对高血压患者冠状动脉钙化的预测价值

ROC曲线显示，miR-297a预测高血压患者冠状动脉钙化曲线下面积为0.859，截断值为0.735，敏感度为88.7%，特异性为86.8%。FGF23水平预测高血压患者冠状动脉钙化的曲线下面积为0.906，截断值为53.49 pg/mL，敏感度为92.5%，特异性为89.5%。详见图1。

图1 miR-297a和FGF23的ROC曲线

3 讨论

冠状动脉钙化是一个类似于成骨的主动过程，致钙化细胞向成骨表型分化形成钙化[9]。流行病学资料表明，冠状动脉钙化在40～49岁人群的发生率达到50%[10]，中国人出现冠状动脉钙化的比率高于黑种人，低于白种人[11]。对于急性心肌梗死患者，冠状动脉钙化明显增加了PCI的难度，可能导致手术困难，术中球囊破裂、术后支架贴壁不全等并发症[12]。除目前临床应用的血管内超声、冠状动脉CT或冠状动脉血管造影等影像学手段外[13]，实验室检测指标对判断钙化程度、预测冠状动脉钙化的发生有其实际意义。

miRNAs已被证实参与生物体多种生命活动，miRNAs涉及调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡及表型变化等各种生理和病理过程，几乎参与了人体一切生命活动的调节和所有疾病发病过程的调控[14]。近年来，文献研究表明，miRNAs在冠状动脉钙化中发挥了重要作用。miR-297a是一个典型的多功能microRNA，位于非编码区基因Pic内[15]。Zheng等[4]通过维生素D3加尼古丁构建大鼠血管钙化模型，通过miRNA芯片检测、筛选大鼠血管钙化模型中差异性表达的miRNA，观察血管钙化过程中miRNA表达谱的动态变化，结果表明miR-297a在血管钙化过程中明显下调。本研究通过qRT-PCR法检测发现，冠状动脉钙化患者miR-297a表达水平显著低于无冠脉血管钙化患者，提示高血压患者血清miR-297a表达情况与冠状动脉钙化的发生密切相关。

FGF23是FGFs家族重要成员之一，由骨细胞及骨成纤维细胞所分泌，在钙磷调节方面发挥重要作用[16-18]。有研究表明，FGF23生理作用为修复受损内皮细胞，促使新血管形成，改善近端肾小管Na-P转运蛋白胞吞作用，促进磷酸外分泌，且能减少血液内1,25（OH）VD含量，减少肠道内磷酸盐吸收，降低血磷表达水平[19]。Jimbo[20]在慢性肾病引起的血管钙化中研究表明，慢性肾病中晚期冠状动脉钙化患者血清FGF23水平较普通人群显著升高，与冠状动脉发生及不良预后密切相关。本研究中，高血压冠状动脉钙化患者血清FGF23水平显著高于健康对照组和无钙化患者，推测FGF23可反应高血压患者体内冠状动脉钙化情况。

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VEMCs）作为心血管系统主要的构成细胞，其由收缩表型向成骨细胞样表型转变，是血管钙化发生、发展的关键病理过程，此过程中涉及血管平滑肌细胞收缩表型的丧失、成骨样细胞表型的获得以及细胞内钙盐的沉积[21-22]。ALP是一组同工酶，是骨钙化过程中的关键酶，VSMCs可在各种钙化因素作用下高表达碱性磷酸酶，ALP酶活性增加促进钙化发生，可反映血管钙化程度[23]。BMP-2是可诱导骨组织形成的局部生长因子，在血清生长因子刺激下可抑制VSMC增殖[24]。MGP与血管钙化密切相关，主要由动脉血管壁平滑肌细胞合成，敲除MGP基因则主动脉钙化严重[25]。

本研究Pearson分析结果表明miR-297a表达水平与血管钙化指标ALP、BMP-2呈负相关，与MGP呈正相关；FGF23水平与血管钙化指标ALP、BMP-2水平呈正相关，与MGP水平呈负相关，提示miR-297a下调表达、FGF23上调表达可能促进高血压患者冠状动脉钙化过程。多因素分析结果显示miR-297a高表达是患者发生冠状动脉钙化的保护因素，FGF23高水平是高血压冠状动脉钙化的危险因素之一。进一步ROC分析结果得出，miR-297a预测高血压患者冠状动脉钙化曲线下面积为0.859，敏感度特异性高，截断值为0.735，表明miR-297a低于0.735时，高血压患者发生冠状动脉钙化风险增高。血清FGF23曲线下面积为0.906，敏感度为92.5%，特异性为89.5%，截断值为53.49 pg/mL。本研究也存在一定不足，miR-297a如何参与调控FGF23抑制冠状动脉钙化还有待进一步研究。

综上所述，血清miR-297a表达降低、FGF23水平升高与高血压患者发生冠状动脉钙化有关，检测血清miR-297a、FGF23水平可评估高血压患者发生血管钙化的风险，具有一定的临床应用价值。