米槠叶片基因组DNA的提取及分析

林莉莉，郭丽倩，陈潇潇，游章湉，游水生，曹世江

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.浙江大学农业与生物技术学院，浙江 杭州 310027；3.中国科学院华南植物园退化生态系统植被恢复与管理重点实验室、中国科学院华南植物园广东省应用植物学重点实验室，广东 广州 510650)

米槠(Castanopsiscarlesii(Hemsl.)Hay.)为壳斗科栲属乔木，是东亚地区具有代表性的建群种，是亚热带地区的常绿阔叶林组成树种之一。它不仅适应温暖湿润多雨的气候，同时也能耐荫，耐瘠薄干旱，适应性强，在福建、湖北、四川、贵州、台湾、日本等地区广泛分布[1-3]。米槠生长迅速，抗风力强，又耐烟尘、抗污染并能杀菌，在营造防火林带中有着广阔的应用前景和发展潜力[4-5]。由于现阶段我国亚热带地区经济发展迅速，人口密度增加，人类对米槠群落的干扰影响比较严重，加之采伐强度大，导致米槠群落退化严重[6]。因此开展米槠DNA提取研究对其分子生物学以及遗传多样性等方面具有重要意义。

高质量的DNA是进行基因检测的重要基础，PCR为基础的基因检测技术在遗传多样性、遗传分析、亲缘关系等各个方面都有广泛的应用[7]，所以得到高质量的DNA是有效用于PCR扩增、基因克隆、基因图谱、进化进程分析的重要基础，是成为植物分子技术分析的首要前提[8-10]。因此出现了针对各种栲属植物，如赤枝栲(Castanopsiskawakamii)[11]、格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)[12]、丝栗栲(CastanopsisfargesiiFranch)[13]、红锥(CastcmopsishystrixA.DC)[14]等植物基因组DNA提取方法的研究，采用了柠檬酸钠法、尿素法、高盐低pH法、SDS法、传统CTAB法和试剂盒提取这6种方法，但至今尚未见有关米槠基因组DNA提取方法的研究报道，参考现有的栲属植物基因组DNA提取方法。本研究采用改良的CTAB法来提取米槠基因组DNA，以期找到高效提取米槠基因组DNA的方法，为其后续PCR、遗传分析等方面的研究及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验所用的米槠叶片采自福州鼓山风景区，根据人类干扰程度的大小选择6个不同的米槠群落(表1)，于2016年6月采集新鲜叶片，冻存于-80 ℃冰箱内。

表1 6个米槠群落的概况

1.2 试剂与仪器

主要试剂为DNA提取缓冲液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，1.0 mol·L-1NaCl，2%(w/v)CTAB，0.5%β-巯基乙醇(使用时现加入))，氯仿，异丙醇，75%乙醇，ddH2O等，所用试剂均为分析纯。主要仪器有：低温离心机，干式恒温器，PCR仪，电泳仪，超微量分光光度计DeNovix，电泳凝胶成像数据分析系统。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 秤取米槠叶片0.05 g于干燥的研钵内，加入适量液氮研磨成粉末，转入1.5 mL离心管中并加入预处理的DNA缓冲液500 μL，65 ℃水浴30 min，期间每隔10 min混匀1次；4 ℃，13000 r·min-1离心2 min，取上层水相并加入氯仿500 μL，混匀后静置2 min；4 ℃，13000 r·min-1离心15 min，取上层水相，加入等体积已加入10%NaAC的异丙醇，上下颠倒混匀，在-20 ℃下醇沉30 min。4 ℃，13000 r·min-1离心15 min，收集沉淀，加入75%乙醇溶解、洗涤；4 ℃，13000 r·min-1离心3 min，重复2次；置于通风橱数分钟，待管内乙醇挥发殆尽，加入ddH2O 100 μL，震荡混匀即为所提取的基因组DNA。

1.3.2 DNA检测 取1 μL DNA样品于超微量分光光度计DeNovix上测定DNA浓度、A260/230、A260/280。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并拍照记录。

1.3.3 PCR检测 以米槠叶片提取的DNA作为模板进行PCR检测。用trnL为引物进行PCR扩增(表2)，反应体系为模板500ng、引物10 pM、ddH2O 8 μL、Master Mix10 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，进行40个循环；再于72 ℃延伸10 min[15]。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过电泳凝胶成像数据分析系统观察并采集图像。

表2分子标记引物序列

2 结果与分析

2.1 米槠叶片DNA的质量浓度和纯度

表3是经超微量分光光度计检测所得的每个米槠群落内5个米槠叶片样品DNA浓度和纯度的平均值。结果表明，试验中所提取的DNA，A260/230值均在2.0左右，说明纯度较高，多糖等杂质较少；A260/280的值均在2.0左右，说明DNA中还有少量的RNA，但不影响后续试验操作。试验提取的米槠DNA质量浓度均在400～750 ng·μL-1之间，DNA得率在80～120 mg·g-1之间，在微量试验中产率较高，说明本方法能够有效的提取到米槠分子生物实验的DNA质量。

表3 6个米槠群落内叶片DNA质量浓度和纯度的平均值

图1 米槠基因组DNA的紫外吸收曲线

图2 DNA琼脂糖凝胶电泳结果

图3 以trnL为引物的PCR扩增产物电泳图

图4 米槠PCR产物测序结果

图5 米槠基因测序部分波峰图

2.2 米槠叶片基因组DNA的质量

试验结果发现，采用该方法所获得的沉淀物能够较好地溶解于乙醇中，在提取过程中多酚类物质影响较小。由图1、图2可知，采用该方法提取的米槠叶片基因组DNA质量好，经过1%琼脂糖凝胶电泳后，条带明显，且只有1条清晰的主带，“拖尾”现象较小，DNA降解和RNA污染的现象也轻，DNA质量稳定。

2.3 PCR扩增结果

图3是以采用trnL为引物的PCR扩增电泳结果。由图3可得，采用本文改良的CTAB法所获得的DNA结果，在trnL引物和反应体系中能够得到稳定的扩增片段，长度约为800 bp，主带清晰、明显，无杂带，重复性好。由此可见，采用该方法所提取的米槠DNA质量高，可以应用于以PCR为基础的分子生物研究。

2.4 米槠叶片基因组DNA测序结果

将PCR扩增结果送到铂尚生物技术有限公司测序得到结果。结果表明本次测定的序列长度均在800 bp左右，图4为第5号米槠群落样品的测序结果之一，序列长度为788 bp，与YU-PIN CHENG利用该引物测序所得结果801 bp相似度高达97.3%[15]，在该基因中A占35.2%，G占15.6%，T占33.2%，C占16.0%，且基因测序结果有效区间的波峰图中主峰明显，没有特异性条带干扰(图5)。因此利用该方法提取的DNA可用于米槠遗传多样性的分析。

3 讨论与结论

米槠属于顽拗植物，细胞中多糖、酚类、单宁等物质含量较多[16]，在提取过程易褐化形成粘稠的物质，严重影响实验操作。通过前期的试验摸索，从中找到适合米槠基因组DNA提取的方法。本次试验提取液中NaCl的含量为1.0 mol·L-1，用量减少，加入0.5%的β-巯基乙醇相较于常见植物DNA提取方法中的0.1%[17]用量有所增加，能够有效地减少提取过程的褐变，与现有格氏栲的方法中3%[12]相比，本方法的用量降低了操作过程的毒性。实验省略了酚氯仿的使用，且氯仿在该过程中只使用1次，又进一步减少了实验操作中的毒性。本方法使用10%的醋酸钠去除基因组DNA中糖类的干扰，在-20 ℃下用异丙醇代替75%乙醇能使DNA更易醇沉。该方法使用的试剂均为实验室常见试剂，操作简单，提取过程相对于试剂盒提取基因组DNA消耗时间少，整个操作时间在2 h左右，且在操作过程中有效调整了β-巯基乙醇的用量，减少氯仿的使用次数，省略了酚氯仿这些有毒物质的使用，相较于传统的CTAB法，本方法毒性较小，操作简单，用时少；相对于试剂盒提取，本方法更加经济实用。

叶绿体是植物细胞质遗传的重要单位，具有相对独立的遗传物质(cpDNA)[18]。叶绿体基因组在植物分子标记[19]、系统发育基因组学[20]等方面有广泛的应用。本试验使用的材料为福州鼓山米槠的叶片，采用幼叶和成熟叶片均能达到良好的效果。利用紫外分光光度计检测，在6个米槠群落样品中均提取到了较好的基因组DNA，提取过程中有效降低了DNA的降解，同时实验结果能够用于PCR扩增DNA模板。基因组DNA和PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中均能够得到稳定的条带，PCR产物条带清晰，“拖尾”现象较少，且扩增结果能够得到稳定序列结果，为今后对米槠不同种群间的遗传序列分析、基因定位等研究提供了较好的DNA提取方法。且利用本方法提取格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)的基因组DNA也取得了比较好的结果，因此本方法能够为米槠和格氏栲等其它栲属植物的DNA提取以及其它分子研究提供参考。