利塞膦酸钠对神经病理性疼痛大鼠模型的抗炎镇痛作用*

卜慧莲 连一闻 许继田 马民玉△

（1郑州大学第一附属医院疼痛科，郑州450052；2郑州大学基础医学院生理教研室，郑州450052）

神经病理性疼痛[1](neuropathic pain, NP) 是中枢和/或外周感觉神经系统损伤所引起的慢性疼痛综合征，其典型的症状包括自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏，该疾病在全球其患病率可高达21.6%，进而越来越被临床医生及基础研究学者重视。在神经损伤后，小胶质细胞释放大量促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β以及IL-6等[2]，由此引起的神经炎症反应是造成NP的重要原因。关于NP的临床药物治疗主要包括局部麻醉药、非甾体类抗炎镇痛药、抗癫痫药及阿片类镇痛药物，非甾体类药物大多具有消化系统副作用，阿片类镇痛药主要作用于外周或脊髓背角的阿片类受体，但长期服用后会产生药物镇痛耐受，同时引起便秘、疲乏、过度镇静等副作用[3]。抗惊厥药目前广泛用于神经病理性疼痛的治疗，但其对认知功能的损害一直是不可忽视的重点[4]。因此寻找新的药物治疗思路显得尤为重要。

利塞膦酸钠 (risedronate, RIS) 是第三代含氮双膦酸盐，主要用于骨质疏松症、骨癌痛及佩吉特病等[5]，最新的《神经病理性疼痛诊疗指南专辑》中提出，双膦酸盐类药物可用于治疗神经病理性疼痛，为B级推荐用药，但关于RIS是否对NP产生抗炎镇痛作用未见有报道。研究表明RIS具有抗炎作用，其在炎性痛动物模型中抑制破骨细胞产生促炎症细胞因子，进而发挥镇痛作用[6]；而破骨细胞与神经小胶质细胞同属于单核吞噬细胞系统[7]，同时Rahn等[8]发现双膦酸盐的一种阿伦膦酸钠减弱了肿瘤诱导的外周和中枢致敏标志物，如星形胶质细胞标志物GFAP，因此推测RIS可能会抑制小胶质细胞分泌促炎症细胞因子来产生镇痛作用，因此本研究旨在探讨RIS对大鼠NP的镇痛作用及其对脊髓 (spinal cord, SP) 和背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 中炎症因子表达的影响。

方 法

1.实验动物

本实验选取230～250 g成年雄性SD大鼠（河南省郑州市实验动物中心），采取分笼饲养，自由摄食饮水，室温24±2℃，湿度60%～70%，8:00～20:00光照，动物适应环境3 d后开始实验。进行疼痛行为学检测的大鼠用随机数字表法分为6组 (n= 8)：假手术 (Sham + saline) 组、手术 (SNL +saline) 组、RIS低剂量治疗 [R (L)]、RIS中剂量治疗组[R (M)]、RIS高剂量治疗组 [R (H)]及空白对照组 (Control + RIS)；其中RIS剂量分别为0.1、0.5、1 mg/kg，0.1 ml/只，采用皮下注射，假手术 (Sham)组、空白对照(C)组及手术 (SNL) 组注射等体积无菌生理盐水。根据上步实验结果，在Elisa检测中将大鼠随机分为4组 (n= 6)：手术组 (SNL + saline)，RIS中剂量治疗组 [R (M)]假手术组 (Sham + saline) 及空白对照组 (Control + RIS)，分别皮下注射0.5 mg/kg RIS或等体积的生理盐水。所有动物实验操作均符合郑州大学动物保护协会和使用委员会的要求，并且与国家动物保护研究所的指南一致。

2.药物

利塞膦酸钠（扬子江药业批号：16122501），以无菌生理盐水配置成相应浓度溶液供皮下注射应用。注射时间为术前30 min至术后7 d，持续注射，每只0.1 ml，每天1次。

3.NP模型制备

本实验依照La Bu Da等[9]的方法采取大鼠左侧第5腰椎脊神经结扎模型(spinal nerve ligation,SNL)，利用异氟醚对大鼠进行吸入麻醉，术区备皮，常规消毒皮肤，铺无菌巾，平髂嵴，双侧髂后上棘连线中点向左旁开0.5 cm做纵行切口，切开皮肤及皮下筋膜，钝性分离显露脊椎，切除L5横突后暴露其下方的L5脊神经，用5-0丝线结扎神经并剪断，用3-0丝线逐层缝合口，大鼠苏醒后禁食1 d，自由饮水，术毕送回动物饲养室，假手术(Sham)组仅暴露L5脊神经，不进行结扎剪断处理。

4.机械性撤足阈值(mechanical withdraw threshold,MWT)的测定

按Tal等[10]的“up-down”方法，选用8根呈对数递增的Von Frey Hair纤毛 (3.61、3.84、4.08、4.31、4.56、4.74、4.93、5.18) ，根据注药方式不同，分别于手术前1 d和术后1、3、5、7、10、14 d检测大鼠50%机械性撤足阈值。将大鼠置于金属网架上，适应环境20～30 min后，首先从4.31开始，通过网眼将纤毛垂直刺向其双侧后肢足底中心处，稍用力直至弯曲成S形，刺激持续时间约为3～4 s，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，若无反应则视为阴性反应。若缩足反应为阴性，则选择相邻递增Von Frey Hair刺激，若缩足反应为阳性，则选择相邻递减Von Frey Hair刺激，首次阳性反应后，应用Up-down法连续测量4次，每次间隔30 s，5次刺激中出现3次及3次以上阳性反应即认为发生机械痛觉超敏。

5.热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的测定

参照Hargreaves等[11]报道的方法，根据注药方式不同，分别于手术前1 d和术后1、3、5、7、10、14 d测定大鼠TWL。调整辐射热强度，使大鼠的基础值维持在12～15 s，来设定热测痛仪的参数。热辐射照射时限设定为19.1 s。将大鼠置于玻璃板上，并罩以透明有机玻璃观察框，大鼠适应环境30 min后，调整辐射光源使其对其大鼠后足足底中心处，光源开始照射足底部，当大鼠出现缩足反射或照射时间达到19.1 s，光源自动关闭，并自动记录持续时间，即为热痛阈值。正常对照大鼠的热缩足潜伏期通常为12～15 s。每侧足测量3次，每次间隔10～15 min，取其均值，作为该侧足的热缩足潜伏期。

6.酶联免疫吸附法(ELISA)

测定脊髓 (SP) 及背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 促炎症细胞因子肿瘤坏死因子 -α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)以及白介素-6 (IL-6)表达测定。在连续注射RIS (0.5 mg/kg) 7 d后将大鼠断头处死，迅速截取L4-6脊髓腰膨大节段及双侧L4、L5背根神经节(DRG)。将组织用微量匀浆器制成匀浆液，采用BCA法测定蛋白浓度后，将蛋白量浓度统一稀释为1 μg/μl。按照ELISA试剂盒说明书测定促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量。将所需包被板条取出，像酶标孔中加入洗涤液300 μl/孔，静置30 s，洗板5次，每次甩掉洗涤液后均需在吸水纸上拍干，尽快使用，避免包被板干燥。参照说明书稀释标准品，再将稀释好的标准品、样本稀释液和样本加到相应孔中，100 μl/孔,用封板纸封住板条，置于室温下 (20～25℃)孵育2 h。洗板5次。按当次实验所需用量提前20 min配置生物素化抗体工作液，用抗体稀释液将浓缩生物素化抗体稀释到所需的浓度，100 μl/孔, 置于室温下 (20～25℃) 用ELISA专用的微量振荡器震荡(100 rpm/min)孵育1 h。洗板5次。

采用Graphpad Prism 5.0软件和SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准误(±SEM)表示，对于大鼠疼痛行为学测试数据分析，比较采用双因素方差分析，相同时间点两组之间比较应用t检验；对于ELISA数据分析，差异性比较采用单因素方差分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。按当次实验所需用量提前20 min配制酶结合物工作液，用酶结合物稀释液将浓缩链亲和素标记的辣根过氧化物酶稀释剂稀释到所需的浓度，100 μl/孔，置于室温下 (20～25℃) 用ELISA专用的微量振荡器震荡(100 rpm)孵育30 min。洗板5次。加显色剂 (TMB)，100 μl/孔，室温下反应，避光显色10～20 min，颜色为蓝色。加终止液，100 μl/孔，轻轻混匀，颜色呈黄色，在5 min内用酶标仪进行双波长检测（450 nm为主波长，570 nm或630 nm为参考波长）。

7.统计学方法

结 果

1.利塞膦酸钠对SNL大鼠机械缩足反应阈值(MWT)的影响

各组术前1 d时MWT比较差异无统计学意义；与术前1 d相比，Sham + saline组、C组双侧、及SNL + saline组、R (M) 组对侧各时间点MWT比较差异均无统计学意义。通过术前30 min至术后7 d皮下注射不同剂量RIS后，与Sham + saline组术侧相比，SNL + saline组、R (L) 组、R (M) 组及R (H)组术侧术后各时点MWT降低 (P＜ 0.05)，C组与Sham + saline组比较差异均无统计学意义；与SNL组术侧比较，在术后3、5、7、10、14 d，R (M) 组术侧 MWT 上升 (P＜ 0.05)，在术后 5、7、10、14 d R (H) 组术侧 MWT 上升 (P＜ 0.05)，R (L) 组术侧各时间点MWT比较差异无统计学意义；与R (M)组术侧比较，在术后5、7、10、14 d时R (L)组及R (H) 组术侧MWT较低 (P＜ 0.05)。结果证明，RIS可减轻神经损伤后大鼠机械性痛觉超敏，并在剂量为0.5 mg/kg时镇痛效果更佳，而对大鼠正常痛阈无明显作用（见图1A，B）。

2.利塞膦酸钠对脊神经结扎大鼠热缩足潜伏期(TWL)的影响

各组术前1 d时TWL比较差异均无统计学意义；与术前1 d相比，Sham + saline组、C组两侧及SNL + saline组、R (M) 组对侧各时间点比较差异均无统计学意义(P＜ 0.05)。与Sham + saline组术侧相比，SNL + saline组、R (L)组及R (H) 组术侧术后5、7、10、14 d TWL均降低 (P＜ 0.05)， R (M)组、C组与Sham + saline组比较差异无统计学意义；与SNL + saline组术侧比较，在术后5、7、10、14 d，R (L) 组、R (M) 组及 R (H) 组术侧TWL升高(P＜0.05)；与R (M)组比较，在术后5、7、10、14 d时R (L)组及 R (H) 组术侧TWL较低 (P＜ 0.05)。结果证明，RIS可减轻神经损伤后大鼠热痛觉过敏，并在剂量为0.5 mg/kg时镇痛效果更佳，而对大鼠正常痛阈无明显作用（见图2A，B）。

图1 术前30 min至术后7 d皮下注射RIS后各组大鼠不同时间点MWT的比较 (±SEM)(A)术侧；(B)对侧 *P ＜ 0.05，与Sham + saline组比较；#P ＜ 0.05，与SNL + saline组比较；△P ＜ 0.05，与R (M)组比较Fig.1 The change of MWT of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats; △P ＜ 0.05, compared with group R (M).

3.利塞膦酸钠对SNL大鼠背根神经节(DRG)中表达的影响

根据疼痛行为学数据分析结果，采取中剂量组0.5 mg/kg利塞膦酸钠进行皮下注射，持续7 d，在术后7 d时，与Sham + saline组比较，SNL + saline组促炎症细胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表达水平升高(P＜ 0.05)；而与SNL + saline组相比，R (M)组中表达水平降低(P＜ 0.05)。结果证明，结果证明，RIS可下调神经损伤后大鼠脊髓(SP)及背根神经节(DRG)内促炎症细胞因子的表达水平，进而对NP产生抗炎镇痛作用 （见图3A-C，4A-C）。

图2 术前30 min至术后7 d皮下注射RIS后各组大鼠不同时间点TWL的比较 (±SEM)(A)术侧；(B) 对侧 *P ＜ 0.05，对侧与 Sham + saline 组比较；#P ＜ 0.05，与 SNL + saline 组比较；△P ＜ 0.05，与R (M)组比较Fig.2 The change of TWL of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats;△P ＜ 0.05, compared with group R (M).

图3 术前30 min至术后7 d皮下注射RIS后各组大鼠术侧SP促炎症细胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表达变化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，与 Sham + saline组比较；#P ＜ 0.05，与 SNL + saline组比较Fig.3 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the spinal cord after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

图4 术前30 min至术后7 d皮下注射RIS后各组大鼠DRG促炎症细胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表达变化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，与 Sham + saline组比较；#P ＜ 0.05，与 SNL + saline组比较Fig.4 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the DRG after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

讨 论

神经病理性疼痛的病理生理机制非常复杂，目前认为神经炎症反应在其中起着重要的作用[12]。在神经损伤后，病理改变不仅仅局限于神经元系统活性的变化，还会引起免疫系统的反应，其中一些免疫细胞可分泌促炎症细胞因子和趋化因子来参与疼痛维持[13,14]。一旦免疫系统激活，组织可释放大量的炎性介质，包括一氧化氮(NO)，TNF-α，IL-1β，IL-6，兴奋性氨基酸、ATP等[15]，这些炎性介质可降低激活阈值或者直接激发神经元。另外，由于鞘内给予IL-1β和TNF受体拮抗剂以及IL-6中和抗体会减弱神经病变模型中的疼痛行为[16]，因此已证明这些促炎症细胞因子介导疼痛超敏反应。

第三代双膦酸盐[5]是骨吸收的抑制剂，利塞膦酸钠可通过调节破骨及成骨细胞的活性、促炎症细胞因子的表达、金属蛋白酶-1 (MMP-1)的表达以及CGRP信号通路的活化等有效缓解骨质疏松症、炎性痛、骨癌痛；但目前利塞膦酸钠对于神经病理性疼痛的具体镇痛机制尚不清楚。双膦酸盐类药物可通过中枢及外周抑制急性痛，且镇痛机制与骨破坏无关[17]；Bianchi和Nakai等[18,19]表明双膦酸盐类药物能够减少大鼠炎性痛模型中伤害感受增加时的炎症性水肿和痛觉过敏。小鼠足底预先注射利塞膦酸钠，可减少福尔马林引起的组织内促炎症细胞因子的表达（例如 TNF-α，IL-1β，IL-6）。Caraglia等[20]报道第三代双膦酸盐可抑制外周神经结扎所引起的神经病理性疼痛。这些研究表明利塞膦酸钠可能通过调节神经系统内的神经化学物质的表达，从而对神经病理性疼痛产生镇痛作用。

本实验采用的脊神经结扎模型 (SNL) 已广泛用于研究神经病理性疼痛的发病机制及治疗方法，本研究结果表明术后大鼠出现了明显的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,提示大鼠模型制备成功；同时表明，SNL大鼠持续注射RIS可减轻其因神经损伤所引起的痛觉过敏和痛觉超敏，并在第7天停药后，镇痛作用持续存在。并且R (M) 组及空白对照 (C) 组对侧的行为学无明显差异，表明不干扰正常的痛觉。本研究结果显示，SNL大鼠术后脊髓 (SP) 及背根神经节 (DRG) 中的促炎症细胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表达明显升高，在持续7天皮下注射RIS后，相应炎症因子明显下降，表明RIS可抑制神经病理性疼痛所引起的炎症因子的表达，进而产生镇痛作用。然而，利塞膦酸钠有剂量依赖性的细胞毒性[21]，本研究结果显示，0.5 mg/kg而非1 mg/kg的利塞膦酸钠可以产生最佳的镇痛作用，可能是因为1 mg/kg的剂量反而有毒性作用，但这需要进一步的研究去证实。

综上所述，本研究结果显示，利塞膦酸钠可通过下调促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，可以抑制过度的炎症反应，减轻神经的炎症损伤，对SNL大鼠产生抗炎镇痛作用，本文未对RIS抑制炎症因子的具体机制进行探讨，推测RIS抗神经病理性疼痛的作用可能与其抑制胶质细胞的活化进而下调促炎症细胞因子的表达有关，该研究为RIS应用于抗神经病理性疼痛提供了实验依据，其具体的作用机制还需要进一步探讨。