多管发酵法测定水质粪大肠菌群的探讨

黎尧 张绍斌

摘要：参照标准方法（HJ/T 347-2007）监测粪大肠菌群项目过程中，发现培养液灭菌后小倒管中气泡难以尽除，培养液保存时间不长等现象，本文通过实验分析找出有效的解决方案，为提高监测结果准确性、保证样品监测时效性、更好地推广应用行业标准提供了参考。

关键词：粪大肠菌群;多管发酵法;气泡残留;保存期

中图分类号：X832  文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2019）05-0-01

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2019.05.066

Abstract：In the process of monitoring the fecal coliforms project according to the standard method （HJ/T 347-2007），it was found that the bubbles in the small inverted tube were difficult to be removed after the culture solution was sterilized， and the preservation time of the culture solution was not long. Through experimental analysis to find effective solutions， in order to improve the accuracy of monitoring results， to ensure the timeliness of sample monitoring， to better promote the application of industry standards to provide reference.

Keywords：Fecal coliform;Multi-tube fermentation;Bubble residue; Shelf life

粪大肠菌群是反映水质受粪便污染程度，是评定水环境质量状况的重要指标之一[1]。目前90%以上的环境监测机构都采用行业标准（HJ/T347—2007）中多管发酵法测定水质粪大肠菌群[2]，然而在前处理过程中，我们发现经过高温灭菌后，培养液中的小倒管仍有气泡，同时灭菌后的培养液常规保存时间不长[3-4]。实验中常规消除气泡干扰的方法是用针管向小倒管里注满培养液后再倒扣放入试管中，这种方法虽然能消除气泡，但是耗时。环境监测任务具有时间、样品量不确定性，且粪大肠菌群水样采集后保存期短，因此需要常备灭菌倒管与培养液。但培养液保存时间不长，往往任务下达时才开始前处理，这样就很难保证样品分析的准确性和时效性。

据此，本文就行业标准结合工作实践进行研究，以期提高前处理效率和培养液保存时间，来保证样品监测结果的准确性和时效性，为更好地推广应用标准方法（HJ/T347—2007）提供参考。

1 实验部分

1.1 实验环境、设备、试剂

生物实验室恒温25℃，恒湿56%，实验室紫外灭菌。

中兴电热恒温培养箱（DH-500型）：工作电压AC220V、50Hz，温度范围室温+5℃～65℃（为实际使用温度）温度波动度：1℃，功率0.4KW;中兴恒温水浴锅（DFD-700）温控范围：室温+5℃～95℃温度误差：±1℃;海尔医用冷藏箱（HYC-260）：箱内温度范2℃～8℃;双哈全自动立式电热蒸汽消毒器（YM50）：储物桶容积50L、温度设定范围室温+5℃～126℃、时间设定范围1～99min 、1～99h、补水水压≥0.35MPa;上海良平电子天平（FA2004）;赛默飞世尔pH计（3STAR）;50ml试管，小倒管，有孔硅胶塞，无孔硅胶塞，试管架，灭菌牛皮纸。

单倍乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨，3g牛肉浸膏，5g乳糖，5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml;三倍乳糖蛋白胨：将30g蛋白胨，9g牛肉浸膏，15g乳糖，15g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，调pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液3ml;EC培养液：将20g胰胨、乳糖5g、胆盐三号5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g溶解于1000ml蒸馏水中。

1.2 实验原理

灭菌方法原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达115℃。在此蒸汽温度下，杀灭各种微生物。

保存方法原理：在无菌状态下，把经过灭菌处理的培养液，装进事先灭菌或经无菌处理的包装容器内，让其储存于不透风、不透气甚至不透光的特定环境中，在常温下无需冷藏也能保持较长时期而成分不变。

1.3 实验步骤

1.3.1 残留气泡实验操作步骤

将10mL单倍乳糖蛋白胨装入50mL试管中，再将小倒管倒扣放入50mL试管中，分别用有孔、无孔硅胶塞塞紧试管，后将50mL试管放入试管架，并用牛皮纸包好乳胶塞并放入消毒器内。设置温度115℃，待温度、达设定值后继续灭菌时间20min。实验数量共8批次，每批次塞有无孔、有空硅胶塞的试管各100支，对应消毒器内温度冷却达到105℃、90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、25℃时，取出试管观察其产气数量。三倍乳糖蛋白胨、EC培养液实验步骤同上。

1.3.2 培养液保存实验操作步骤

将10ml单倍乳糖蛋白胨装入100支50mL试管中，每支试管10mL該培养液，再将小倒管倒扣放入50mL试管中，分别用有孔、无孔硅胶塞各50个塞紧试管，后放入试管架，并用牛皮纸包扎乳胶塞后放入消毒器内。设置温度115℃，待温度、达设定值后继续灭菌时间20min。将灭菌后的试管取出，并取下灭菌时包裹的牛皮纸，再包装上紫外灭菌的干燥牛皮纸。实验数量每批次有空硅胶塞、无孔硅胶塞各50支，共4批次。分别于30d、60d、90d、120d按批次将装有单倍乳糖蛋白胨的试管放入温度设置为37℃电热恒温培养箱中培养24h，取出观察情况。三倍乳糖蛋白胨实验步骤同上;EC培养液灭菌、保存步骤、实验数量同上，按批次放入温度设置为44.5℃的恒温水浴锅中培养24h。取出观察情况。

2 结果与讨论

2.1 残留气泡去除实验

从表1可见，两种条件下的样品在灭菌锅内温度下降到80℃及以上时开盖，带有气泡的试管数量几乎无变化;80℃～60℃开盖，带有气泡的试管数量逐渐减少;60℃～40℃开盖，带有气泡的试管数量明显降低;40℃～25℃开盖带有气泡的试管数量下降趋于稳定;待灭菌锅内温度冷却至室温时开盖，气泡去除率最高。两相对比，塞有孔硅胶塞样品的气泡去除近100%，效果明显优于塞无孔硅胶塞样品的气泡去除效果。

2.2 培养液保存实验

从表2可见，塞有孔乳胶塞的样品，60天保存期内符合行业标准的分析要求。保存60～120天的样品，随保存时间增加，样品干扰数量增加。最佳保存期是60天以内。塞无孔硅胶塞的样品，三倍乳糖蛋白胨保存至120天时，有2支不符合标准要求外，其余均能满足标准要求。两相对比，塞无孔硅胶塞样品的保存时间明显优于塞有孔硅胶塞样品。

3 结论

通过实验比对，选取有孔硅胶塞作为密封塞，灭菌时小倒管中气泡的去除率近100%，培养液保存期达60天。有效消除了试管中气泡残留的干扰，最大限度地增加了培养液的保存期限。期望通过文本的研究，可以在方法（HJ/T 91-2002）的实际操作中能够提高前处理效率，保证样品分析的准确性和时效性。

参考文献

[1]GB3838-2002，地表水环境质量标准[S].

[2]HJ/T 91-2002，地表水和污水监测技术规范[S].

[3]黄彬汉.液体培养基保存方法[J].微生物学通报，1986， 13（3）：47-48.

[4]王开校.培养基保存方法的改善[J].中国医药指南，2014（19）：110-111.

收稿日期：2019-01-27

作者简介：黎尧（1984-），男，汉族，本科学历，工程师，研究方向为环境监测。