清毒伸筋汤对胶原诱导的关节炎大鼠血清VEGF含量的影响

龙朝阳，蒋桂江，钟丽雁，梁艳，李凤珍，李妮，王苑俪，李新明

(广西国际壮医医院，广西 南宁 530201)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一类以关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫病。临床主要表现为对称性、多关节性、慢性炎症病变，可累及多个系统。其具体发病原因和机制至今仍未完全明了，可能与遗传基因等相关[1-2]。关节滑膜炎为其基本病变之一[3]。血管新生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳形成不可或缺的一部分，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为血管新生的重要诱导剂，起着关键作用。本研究选择胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritic，CIA)大鼠模型，探讨清毒伸筋汤对大鼠血清VEGF的影响，揭示其阻止RA骨破坏的作用机理。

1 实验材料与方法

1.1 动物 清洁级、雌性 Wistar大鼠，体重(200±30)g，购自广西医科大学实验动物中心(动物许可证号：SCXK 20160005)。

1.2 试剂 弗氏不完全佐剂(Sigma公司，批号：SLBS1330V)，牛Ⅱ型胶原蛋白(北京Solarbio公司，批号：1122D056)，VEGF试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号25413441111)。

1.3 药物 甲氨蝶呤(MTX，上海信宜药厂有限公司，批号：1807703)，清毒伸筋汤(组成：肿节风20 g，忍冬藤20 g，救必应20 g，青风藤15 g，两面针15 g，鸡血藤15 g，伸筋草15 g)，免煎颗粒(江阴天江药业有限公司生产，批号：1706070、1706082、1707118、1706024、1708101、1708175、1707035)。

1.4 造模方法 按文献记载方法[4]，在无菌条件下，取浓度4 mg/L牛Ⅱ型胶原蛋白溶液与浓度为1 g/L弗氏不完全佐剂等体积反复混合，充分乳化至“油滴水状”。造模时每只大鼠背部多点皮内注射上述混合乳液共0.25 ml，需于初次、第14 d共2次注射混合乳液致炎。造模成功的判断方法：采用Wood氏的关节炎评估标准评价各组大鼠关节炎指数(AI)，具体内容如下：每只足爪损害分为0～4级，计分对应0～4分，计算4个足爪的总分。正常为0分;1个指关节红肿为1分;2个及以上指关节或整个足爪轻度红肿为2分;足爪红肿较重为3分;足爪重度红肿，缺乏弹性为4分。积分大于或等于4分即认为造模成功。

1.5 实验分组 60只大鼠，随机选出10只为正常组，其余大鼠造模，选取50只造模成功大鼠，随机分为5组(模型组、清毒伸筋汤高剂量组、清毒伸筋汤中剂量组、清毒伸筋汤低剂量组、甲氨蝶呤组)，每组10只。

1.6 治疗方法 灌胃给药。动物用药量换算参照文献[5]，按“mg/kg折算mg/m2转换因子”计算法，具体公式：大鼠用药量=(大鼠转换因子÷人转换因子)×人用药量。正常组、模型组自由饮水;清毒伸筋汤高、中、低剂量组，分别以相当于2倍临床常用量(41.14 mg生药/kg大鼠)、1倍临床常用量(20.57 mg生药/kg大鼠)、0.5倍临床常用量(10.29 mg生药/kg大鼠)的消毒伸筋汤免煎颗粒配成药液，每日分2次灌胃;甲氨蝶呤组以相当于1倍临床常用量(9.20 mg/kg)配成药液，每周1次灌胃。连续治疗4周。

1.7 指标检测

1.7.1 关节炎指数评分 采用Wood氏的关节炎评估标准评价各组大鼠关节炎指数。

1.7.2 VEGF检测 治疗结束后，各组大鼠取血，分离血清。采用ELISA法检测VEGF含量，具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用两组独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

甲氨蝶呤组AI与VEGF含量均较模型组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。清毒伸筋汤中、高剂量组AI改善情况、VEGF含量变化优于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明清毒伸筋汤能减轻CIA大鼠关节肿痛症状，抑制其体内VEGF表达，从而改善病情。清毒伸筋汤低剂量组与模型组比较，AI与VEGF含量差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明清毒伸筋汤不同剂量对疗效有影响，临床常用剂量可起到治疗效果。见表1。

表1 大鼠关节炎指数积分及血清中VEGF含量 ±s，n=10)

表1 大鼠关节炎指数积分及血清中VEGF含量 ±s，n=10)

注：与模型组比较，a：t=2.117，P=0.048;b：t=4.529，P＜0.001;c：t=3.638，P=0.002;d：t=1.023，P=0.320;e：t=21.912，P＜0.001;f：t=25.249，P＜0.001;g：t=16.462，P＜0.001;h：t=1.810，P=0.087

组别 剂量(mg/kg) AI VEGF(μg/L)正常组32.47±4.06模型组 - 12.50±1.72 142.84±7.04甲氨蝶呤组 9.20 10.90±1.66a 83.36±4.91e清毒伸筋汤高剂量组 41.14 9.60±1.07b 69.30±5.94f清毒伸筋汤中剂量组 20.57 10.00±1.33c 90.23±7.25g清毒伸筋汤低剂量组 10.29 11.80±1.32d 136.29±9.01-0 h

3 讨论

RA壮医病名为滚克，缘于患者身体虚弱，风毒、寒毒、湿毒、热毒乘虚而入，阻滞龙路、火路及气道、谷道、水道，使天地人三气不能同步而致病，在治疗上以清热毒、祛风毒、除湿毒，通龙路、火路气机为主[6]。清毒伸筋汤是广西名中医李凤珍主任医师经验方，由肿节风、忍冬藤、救必应、青风藤、两面针、鸡血藤、伸筋草组成，具有清热毒、祛风毒、除湿毒、疏通龙路和火路气机作用，长期临床应用治疗RA急性期收到良好的治疗效果，无明显毒副作用，前期研究表明清毒伸筋汤能降低CIA大鼠血清中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β水平，抑制炎症反应[6]。现代药理研究表明方中主要药物具有抗炎、止痛等作用。如：肿节风的有消炎作用，在抗肿瘤治疗中对化疗药环膦酰胺有增效、减毒作用[7]。救必应有一定的镇痛作用[8]。青风藤主要含有青藤碱，青藤碱在RA治疗中具有免疫抑制、抗炎镇痛、抑制滑膜血管新生、抑制细胞增殖和凋亡、抑制骨破坏的作用[9-11]。石宇红等[12]研究发现，青藤碱能下调缺氧诱导因子-1α的表达及 VEGF、金属蛋白酶-9水平，抑制滑膜新生血管生成，从而减轻关节炎症症状。两面针有明显的镇痛、抗炎作用，还有一定的保肝作用，其镇痛机制可能与抑制中枢的前列腺素2、一氧化氮、丙二醛的释放，提高其抗氧化能力有关[13-14]。鸡血藤有双向调节免疫功能、镇痛、保护肝损伤等作用[15-16]。伸筋草生物碱有一定的抗炎作用，能降低佐剂性关节炎大鼠血清肿瘤坏死因子-α、白介素-1β水平，改善关节滑膜病变[17]。

新生血管在RA中起着不可或缺的作用[18]，而VEGF又在血管新生中发挥重要作用。VEGF可直接促进滑膜血管翳形成、加重滑膜炎症及骨与关节软骨的破坏。新生的血管为增殖的滑膜细胞供氧和提供营养物质，在炎症的持续过程中起重要作用[19]。研究表明VEGF及其特异性受体在关节炎形成早期开始就起着重要作用，影响着血管新生及病程进展，与病情严重程度相关[20-23]。

本研究显示经治疗后，各给药组AI与VEGF含量均模型组低。其中，与模型组比较，清毒伸筋汤中、高剂量组AI明显降低、VEGF含量明显下降。由此，推测清毒伸筋汤能抑制VEGF的表达，从而抑制滑膜炎新生血管的形成，减轻关节骨质破坏。研究从细胞分子角度为清毒伸筋汤临床应用提供新的实验依据。