小檗碱对人肝癌SMMC-7721细胞bcl-2、bax表达的影响

任晓凤 许亚军

黄河三门峡医院 河南科技大学附属黄河医院，河南省三门峡市 472000

肝癌发病率在国内居高不下。前人基础研究多集中在药物肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡率的影响，但是未对凋亡相关蛋白做深入研究。近年来研究发现，小檗碱(Berberine，Ber)对数种肿瘤细胞有抑制作用，例如人肝癌细胞HepG2和人胃癌细胞BGC-803等[1-2]。本文拟研究Ber对肝癌SMMC-7721细胞的增殖及凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响，探讨Ber的抗肿瘤应用，为临床提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞购自中国科学院细胞库。RPMI-1640培养液购自Thermo Fisher Scientific公司。胎牛血清购自兰州荣晔生物科技有限公司。Ber购自Sigma-Aldrich公司。CCK8购自武汉博士德生物工程有限公司。Bcl-2抗体、bax抗体和β-actin抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养与药物干预 将人肝癌SMMC-7721细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2、无菌、恒温、恒湿培养，取3-4代的细胞用于实验。药物干预确定分组：对照组为RPMI-1640培养液培养；实验组加入Ber使终浓度分别达到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L。分别培养24h、48h和72h。

1.3 CCK8检测细胞增殖抑制率 SMMC-7721细胞用0.25%胰酶消化后均匀接种在96孔板内，贴壁后加入Ber使终浓度达到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，每种浓度设5个复孔，分别作24h、48h、72h后，每孔加入CCK8溶液10μl再无菌培养1.5h，490nm波长测量各孔吸光度值，计算各组增殖抑制率。

1.4 Western blot检测bcl-2和bax蛋白的表达 选取对数期SMMC-7721细胞接种于6孔板，长满80%后加入Ber使终浓度达到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，继续培养48h，RIPA裂解液裂解，BCA法蛋白定量，12%SDS-PAGE凝胶电泳，半干转印后使用5%脱脂奶粉室温封闭3h，加入小鼠源bcl-2抗体(1∶200)、bax抗体(1∶200)和β-actin抗体(1∶200)4℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次，加入含HRP的抗小鼠二抗室温孵育3h，再次用1×TBST洗膜3次，采用BIO-RAD化学发光成像系统曝光，Image Lab软件分析条带。

2 结果

2.1 Ber抑制SMMC-7721细胞生长 经Ber处理过的SMMC-7721细胞出现缩小、皱缩现象。实验结果显示，随着Ber浓度的增加和作用时间的延长，细胞的生长被Ber逐渐抑制，有一定的浓度依赖性和时间依赖性，同时在0.2mmol/L浓度和48h时间点条件下，抑制率最高(见表1)。提示Ber可在体外抑制SMMC-7721细胞生长。增殖抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

表1 Ber对SMMC-7721细胞增殖的影响

注：a指与Ber 0.1mmol/L组相比，P<0.05；b指与Ber 0.2mmol/L组相比，P<0.05；*指与24h相同浓度组相比，P<0.05；#指与48h相同浓度组相比，P<0.05。

2.2 Ber上调SMMC-7721细胞bax表达，下调bcl-2表达，促进凋亡 选取48h条件下Ber最适浓度0.2mmol/L干预SMMC-7721细胞，做Western blot发现，与对照组相比，实验组bax蛋白表达明显增高(P<0.001)，bcl-2蛋白表达明显降低(P=0.026<0.05)，bax/bcl-2比值明显增高(P<0.001)，差异均有统计学意义。说明Ber可以通过上调bax蛋白表达、bax/bcl-2比值和下调bcl-2蛋白表达，从而介导SMMC-7721细胞凋亡(见图1)。

图1小檗碱对SMMC-7721细胞bcl-2及bax蛋白表达的影响

注：a指与对照组相比，P<0.05。

3 讨论

肝癌发病率高，病死率也高。目前药物治疗多管齐下，使患者生存时间延长。考虑到中草药为我国独有，尤其小檗碱源自黄连，为一种季铵生物碱，取材与获取方便，以往研究发现该药具有多种作用，除具有明确抗炎作用外[3]，近年来研究较多的是抗肿瘤作用，研究证实其对肝癌、胃癌、乳腺癌等均具有抑制作用[4-8]，也有少数学者研究证实小檗碱对高血压导致心室重塑[9]、糖尿病[10-11]、精神分裂症[12]等亦有效。

笔者研究发现，Ber对肝癌细胞SMMC-7721有显著的抑制作用，这种抑制作用可能与上调bax蛋白、bax/bcl-2比值及下调bcl-2蛋白表达有关。通过采用不同时间、不同浓度Ber作用于体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞后，发现Ber可以在体外抑制人肝癌细胞的增殖，特别是在48h最为明显。同时发现，Ber通过高表达bax、低表达bcl-2来介导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，从而证实了与文献中Ber对肝癌细胞等有抑制作用类似[1,4]。然而，Ber通过何传导通路来抑制肝癌细胞SMMC-7721，需要进一步研究。