石榴皮多酚对人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠合理剂量及毒性作用研究

刘 盟， 王春梅， 宋建忠， 常占瑛， 高晓黎

(新疆医科大学1附属肿瘤医院药学部， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054； 3药学院， 乌鲁木齐 830011)

石榴皮(GranatiPericarpium)为石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)落叶灌木或小乔木石榴(PunicagranmumL.)的干燥果皮[1]，主要化学成分为安石榴苷(Punicalagin)、鞣花酸(Ellagic Acid)、石榴皮鞣素(Punicalin)和没食子酸(Gallic Acid)等，具有杀虫、涩肠、止血等功效，临床上主要用于胃寒症、肾寒症、尿闭、肝水肿、肿瘤等疾病的治疗[2-3]。本课题组前期研究表明石榴皮多酚具有抗肿瘤活性[4-5]，体外肿瘤细胞模型实验证实石榴皮多酚对前列腺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞均有抑制增殖作用[6-8]。本研究采用上下法检测石榴皮多酚对PC-3荷瘤小鼠的合理剂量，并采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin and eosin, HE)法检测石榴皮多酚对PC-3荷瘤小鼠心脏、肝脏和肾脏组织的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器BSA124S型电子天平(德国塞多利斯公司)，R201B型旋转蒸发仪器(上海弗鲁克机电公司)，3131型二氧化碳培养箱(美国赛默飞世尔公司)，CKX41型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，HC-3018R型离心机(合肥中科中佳公司)，UV-2550PC型紫外-可见分光光度仪器(日本岛津公司)。

1.2 试药DMEM培养基(购自赛默飞世尔公司公司，批号NXL0741)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司，批号GVG0077)。

1.3 细胞人前列腺癌PC-3细胞株购自中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库。

1.4 实验动物SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠，3～4周龄，体质量(20.0±2.0)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘) 2009-0004。

1.5 药材石榴皮药材购于新疆喀什市药材市场，经新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授鉴定为石榴科石榴属植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮。

1.6 方法

1.6.1 石榴皮多酚的提取纯化方法 取石榴皮药材，粉碎，过80目过筛，用60%乙醇浸渍提取3次，每次30 min，合并过滤减压浓缩，冷冻干燥后得石榴皮多酚粗提物。经HPD大孔吸附树脂纯化，用1.2 mol/L盐酸调节pH值为2，上样吸附12 h后，用蒸馏水-乙醇梯度洗脱，将洗脱液减压浓缩后冷冻干燥即得石榴皮多酚纯化物，备用。

1.6.2 人前列腺癌PC-3细胞培养方法 将人前列腺癌PC-3细胞接种于DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，取对生长期人前列腺癌PC-3细胞用于实验。

1.6.3 石榴皮多酚对裸鼠LD50的测定方法 使用AOT425 StatPgm程序将级数因子(Sigma)设定为0.6，使用推荐的给药剂量175、700、2 800 mg/kg进行给药，裸鼠给药后观察14 d，记录裸鼠中毒症状，将裸鼠存活和死亡的数据输入AOT425 StatPgm程序中，计算石榴皮多酚对裸鼠的LD50值及95%置信区间。

1.6.4 前列腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的构建方法[9]取“1.6.2”项下人前列腺癌PC-3细胞用PBS清洗，经0.25%胰酶消化后，用DMEM培养基制成细胞浓度为1×107个/mL的人前列腺癌PC-3细胞悬液。各实验组裸鼠腹部皮肤消毒后，用1 mL注射器取0.2 mL细胞悬液(2×106个细胞)接种于裸鼠腹部皮下，以腹部出现黄豆大小硬结节为模型构建成功标准。

1.6.5 动物分组及给药方法 将建模成功的人前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠饲养于温度25℃、湿度40%的环境中，自由饮食饮水。取肿瘤体积100～300 mm3的裸鼠32只随机分组为：阴性对照组(生理盐水，100 mL/kg体质量)、石榴皮多酚低(80 mg/kg体质量)、中剂量组(112 mg/kg体质量)、高剂量组(187 mg/kg体质量)，每组8只，各组裸鼠每天灌胃1次，连续灌胃17 d。

1.6.6 HE组织病理检测方法 取人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠新鲜肿瘤组织块，用10%福尔马林溶液固定，脱水后将肿瘤组织石蜡包埋，切片后进行HE染色，显微观察并拍照。

2 结果

2.1 石榴皮多酚对裸鼠LD50的测定结果根据AOT425 StatPgm程序计算得石榴皮多酚对裸鼠的LD50为2 800 mg/kg，95%置信区间为981.8～ 3 250.0 mg/kg，见表1。

2.2 石榴皮多酚对人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠心脏、肝脏和肾脏组织的影响给药期间各组人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠饮食、精神状况较好，荷瘤小鼠体质量未见明显下降。石榴皮多酚低剂量组荷瘤小鼠心脏、肝脏和肾脏组织未见病理性改变。石榴皮多酚中剂量组荷瘤小鼠心脏组织中少部分心肌细胞噬酸性病变，心肌间质部分血管充血(图1A和1B)，肝脏组织中少部分肝窦血管扩张，并伴有炎性细胞浸润(图1D和1E)。石榴皮多酚高剂量组荷瘤小鼠心脏组织中部分心肌间质出现少量炎性细胞浸润(图1A和1C)，肝脏组织中肝窦扩张充血，有炎性细胞浸润(图1D和1F)，肾脏组织中肾近曲小管轻度水肿(图1G和1I)。

表1 石榴皮多酚对裸鼠的LD50

图1 石榴皮多酚对荷瘤小鼠心脏、肝脏和肾脏组织的影响作用(HE×400)

3 讨论

新药在开展临床试验前必须进行动物模型急性毒性实验，这是新药安全性评价的重要环节，本研究在前期实验基础上进一步探究石榴皮多酚对人前列腺癌细胞PC-3荷瘤小鼠的急性毒性作用，采用上下法[10-11]计算石榴皮多酚对人前列腺癌细胞PC-3荷瘤小鼠的合理给药剂量，实验方法与张方舟等[12]采用上下法计算薄荷油的急性毒性LD50报道一致。研究结果表明石榴皮多酚中、高剂量组人前列腺癌细胞PC-3荷瘤小鼠的心脏、肝脏和肾脏组织有炎性细胞浸润作用，但未见病理性损伤，这与石榴皮多酚抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用有关[13-15]，本研究为石榴皮多酚抗前列腺癌作用的研究提供了理论依据。