血清circRNA与甲状腺乳头状癌的相关性研究

白 超， 杨雯雯， 罗 军， 田 野， 张 磊， 杨镇玮， 王 亮， 依地热斯·艾山

(新疆医科大学1第一临床医学院血管甲状腺外科， 乌鲁木齐 830054； 2第二附属医院内分泌科， 乌鲁木齐 830028)

甲状腺结节是头颈部常见的多发病，近年来有高发的态势，人群中甲状腺结节的检出率也随之升高，检出结节中恶性的占比为10%～15%[1-2]。在恶性结节中，甲状腺微小乳头状癌明显增多。甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroid mircocarcinoma，PTMC)被定义为甲状腺乳头状癌病变最大处的直径≤1 cm，是最“懒惰”的甲状腺恶性肿瘤[3-4]。这类PTMC患者多数由于甲状腺结节的生长位置较深而且结节体积较小，不适合做穿刺活检。虽然甲状腺影像报告和数据系统(Thyroid imaging reporting and data system，简称为TI-RADS)[5]被广泛采纳，该系统更加客观的判断甲状腺结节的性质，但临床中仍有一部分结节难以判断其良、恶性。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是20世纪70年代在植物类病毒中发现的一类非编码的RNA，其单链和共价封闭的RNA，缺少3′游离帽子端或5′多聚尾巴端[6-7]。哺乳动物的细胞中广泛存在着环状RNA分布[8]，环状RNA在细胞中稳定存在[9]，而且具有miRNA海绵的功能，即吸附miRNA[10]。近1～2年来circRNA与恶性肿瘤发生和发展的相关性已经成为学术界研究热点，例如：circRNA与膀胱癌的发生、发展的相关性研究[11]，circRNA与乳腺癌早期诊断的相关性研究[12]，circRNA与结肠癌的发生、发展的相关性研究[13]，circRNA与抑肝癌细胞增殖的相关性研究[14]等。虽然circRNA与人类各种恶性肿瘤之间的关系已经得到了一定的评价和建立，但是circRNA在PTMC中的诊断价值和生物学功能的作用研究较少，Vea等[15]研究表明circRNA在红细胞、白细胞及血清中均有大量的表达。

本研究比较PTMC不伴颈部淋巴结转移的患者和结节性甲状腺肿(nodular goiter，NG)患者血清中circRNA表达的差异，探讨circRNA在PTMC发生、发展中的作用，寻找可能的甲状腺癌血清标记物，帮助临床医师在术前对甲状腺结节良、恶性进行初步鉴别，并以此为基础，为甲状腺结节患者制定下一步治疗方案，以此提高甲状腺结节的诊断和治疗水平。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2018年11-12月在新疆医科大学第一附属医院甲状腺外科行甲状腺切除术，并经病理证实的结节性甲状腺肿患者(NG组)和PTMC患者(PTMC组)各13例，均为女性。收集研究对象的一般资料。术前收集患者晨起空腹上肢静脉血5 mL，离心得血清，将其储存在-80℃的冰箱内，解冻后可使用。2组各选取3名患者进行circRNA芯片检测(NG组3例患者年龄分别为40、52和60岁；PTMC组3例患者年龄分别为40、49和53岁)，后再各选取3例对circRNA芯片检测结果进行验证，2组各剩余7例，对血清样本进行circRNA扩大样本验证。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核并批准(伦理审批号为：20181029-17)。手术前告知患者其权利和义务，并签署书面知情同意书。纳入标准:(1)年龄>18岁；(2)甲状腺结节直径≤1 cm；(3)均无甲状腺恶性肿瘤家族史；(4)均无头颈部放射史；(5)均无甲状腺疾病病史，未行甲状腺手术史。排除标准:(1)术前已经使用补充甲状腺素药物或者抗甲状腺素药物；(2)肝肾功能异常的患者；(3)妊娠期患者。

1.2 方法

1.2.1 circRNA表达谱芯片检测 circRNA表达谱芯片检测委托上海康成生物有限公司进行。

1.2.1.1 实验步骤 (1)血清总RNA的提取(提取方法参阅Trizol-LS Invitrogen说明书)，包括冷冻血清解冻、血清匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗及重新溶解RNA沉淀过程；(2)RNA质量检测；(3)RNA浓度测定，使用NanoDrop-1000超微量分光光度仪测定RNA的浓度和纯度；(4)总RNA的质量检测；(5)样品标记；(6)标记扩增后的cRNA并质检；(7)芯片预杂交；(8)配制杂交液；(9)芯片杂交；(10)洗片；(11)芯片扫描。

1.2.1.2 实验主要试剂、仪器和设备 TRIZOL-LS试剂(购自Invitrogen Life technologies)，Cy3标记链霉亲和素(购自sher Scientific公司)，CyDyev Fluors(CF)荧光染料(购自Healthcare公司)，RNA扩增试剂盒(恒温扩增法)(购自kiinina公司)，DEPC(购自gma公司)，琼脂糖(Agarose)(购自owest公司)，无RNA酶的水(购自vitrogen life technologies公司)。Agilent扫描仪(购自安捷伦科技有限公司Agilent)，NanoDrop-1000超微量分光光度仪(购自Thermo Scientific公司)，计算机图像分析系统(购自Leica Qwi 3)，基因芯片杂交仪(购自Leica公司)。

1.2.2 circRNA芯片数据的生物信息学分析 circRNA芯片数据的生物信息学分析委托上海康成生物有限公司进行。

1.2.2.1 差异基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)筛选 将原始数据导入生物通路可视化软件，采用基因表达差异显著性分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。通过R语言的limma语言包对芯片原始数据进行统一的标准化处理。

1.2.2.2 聚类分析 采用Pusamen和Cluser 2.2软件，将数据导入其中，进行聚类分析，上述软件将算得的结果以聚类图的形式进行输出。

1.2.2.3 基因本体(Gene Ontology)分析 采用DAVID分析软件，将PTMC组和NG组2组间存在差异表达的环状RNA数据导入DAVID，DAVID软件对导入的数据进行分析后，将自动计算出分类的每个种类、每个种类所包含的基因、P值等内容，再根据P值的大小依次将结果进行输出。

1.2.2.4 信号通路分析 将“1.2.2.3”基因本体分析步骤中获得的数据导入Pathway Studio 5.0软件和DAVID分析软件，在软件中选择信号通路分析的功能，软件会自动输出与基因相关的信号通路，并计算出P值的大小。

1.2.2.5 circRNA/miRNA结合位点分析 使用美国Arraystar公司的miRNA结合位点预测软件为前面部分得出的每个差异倍数在1.5倍以上的circRNA预测5个具有较高匹配值的miRNA结合位点，形成circRNA-miRNA关系网络图。

1.2.3 RT-PCR验证 RT-PCR验证委托乌鲁木齐市格林金诺生物科技有限公司进行，采用RT-PCR实验原理进行验证。

1.2.3.1 选择验证的circRNA 基于PTMC组和NG组基因芯片的检测，根据2组circRNA差异表达的Fold change倍数和P值，选取了3个上调的circRNA和3个下调的circRNA进行RT-PCR验证。

1.2.3.2 聚合酶链式反应PCR (1)引物合成：逆转录PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成，以管家基因GAPDH为内参(表1)。(2)Real time-PCR反应;(3)PCR扩增。

表1 RT-PCR所用引物

1.2.3.3 数据读取 打开Agilent数据处理软件Feature Extraction进行芯片扫描数据的读取。

1.2.3.4 数据分析 采用Aglieng提供的锌芯片扫描仪扫描芯片，对低强度信号值进行过滤。借助截尾均数(Trimmed Mean，TM)对芯片的初始信号值进行统一的标准化处理。

2 结果

2.1 circRNA表达谱芯片检测

2.1.1 血清提取总RNA质检结果和cRNA荧光染料的标记效率

2.1.1.1 RNA浓度和纯度测定 所有样品的A260/A280的比值为1.12～1.57，样品浓度为189.14～288.03 ng/μL(表2)。

2.1.1.2 cRNA特异性标记活性 对1 μg cRNA采用Cy3染料进行标记，特异性标记活性即为每1 μg cRNA中含有多少pmol的染料，放射性比度=(pmol per μL dye)/(μg per μL cRNA)。如果出现染料呈双色，则收益率是<825 ng和放射性比度<8 pmol Cy3或Cy5每μg cRNA不进行杂交步骤。重复cRNA准备。如果染料为一种颜色，收益率是<1.65 μg和放射性比度<9 pmol Cy3或Cy5每μg cRNA不进行杂交步骤。重复cRNA准备(表3)。

表2 利用NanoDrop ND-1000进行RNA定量和质量保证

表3 cRNA的标记效率

2.1.2 circRNA芯片数据分析

2.1.2.1 所有表达的circRNA circRNA芯片检测到12 900个circRNA在NG、PTMC血清中表达，检测6个血清样本中这些circRNA的表达水平的一致性，进一步分析其表达差异。芯片检测到的部分circRNA信息，包括原始circRNA信号值，标准化后的信号值，基因表达水平标识，基因序列、类型等见表4。

表4 xls.格式的circRNA表达配置文件片段

注：probe ID：探针序列号；circRNA：circular RNA序列号；NG1～PTMC3(raw)：各个标本的原始信号强度；NG1～PTMC3(normalized)：各个标本的原始信号强度标准化后取对数值(log2 transformed)。

2.1.2.2 circRNA数据的质量评估 箱形图是将数据的分布采用四方形的盒子形式加以形象地展示，可以从视觉的效果上快速简便地观察一组数据的分布情况，包括集中趋势和离散趋势(图1)。

2.2 circRNA芯片数据的生物信息学分析

2.2.1 PTMC血清中差异表达circRNA的筛选 筛选差异基因标准是P<0.05，组间差异倍数>1.5，结果得到差异表达的circRNA有20个，其中表达上调的circRNA有14个，分别是hsa_circRNA_406821，hsa_circRNA_406395，hsa_circRNA_003416，hsa_circRNA_407160，hsa_circRNA_087192，hsa_circRNA_001359，hsa_circRNA_000639，hsa_circRNA_104982，hsa_circRNA_100015，hsa_circRNA_104640，hsa_circRNA_104172，hsa_circRNA_001131，hsa_circRNA_407191，hsa_circRNA_081199。下调的circRNA有6个，分别是hsa_circRNA_043614，hsa_circRNA_104755，hsa_circRNA_103037，hsa_circRNA_101871，hsa_circRNA_405481，hsa_circRNA_103944。

采用火山图直观显示NG组与PTMC组中血清学差异表达的circRNA。图中红色方格代表差异基因，两条绿色垂直线对应差异倍数为1.5，绿色水平线对应P=0.05(图2)。

图1 NG 1～3及PTMC 1～3 circRNA分布箱型图

图2 NG1～3及PTMC1～3 circRNA表达火山图

2.2.2 差异表达circRNA的亲本基因的本体(Go)分析 PTMC组中差异表达的20个circRNA，其中上调的14个circRNA的亲本基因包括：ARMC2，ECT2，TMSB4X，CNTLN，TMEM2，SELL，SETBP1，TXLNG，GNB1，CSPP1，FIG4，ACTR1B，AL161626.1，MGC720；下调的6个circRNA的亲本基因包括：KRT14，UBAP2，EDEM2，ZFHX3，TERF2，SEC24A。PTMC中差异表达上调circRNA的亲本基因本体分析，分别选择排名前10的生物学过程、细胞组分和分子功能中Enrichment score(图3)。

图3 NG与PTMC差异表达的circRNA亲本基因的Go富集分析

2.2.3 circRNA/miRNA的结合位点分析 对每个差异表达的circRNA预测5个具有高匹配值的miRNA结合位点，每个circRNA/miRNA结合注释。挑选上调和下调各3个circRNA进行罗列(表5)。

表5 与PTMC、NG上/下调circRNA高匹配的miRNA

2.2.4 circRNA-miRNA-mRNA网络图 circRNA-miRNA-mRNA网络图中黄色圆点代表circRNA，红色圆点代表miRNA，蓝色圆点代表miRNA靶信使RNA(Messenger RNA，mRNA)，具体见图4。

图4 circRNA-miRNA-mRNA网络图

2.2.5 Pathway分析 通过KEGG-Pathway分析，明确NG患者与PTMC患者血清中的差异表达circRNA相关的基因参与了Olfactory transduction通路(37个基因)(图5)。

图5 Pathway分析

2.3 RT-PCR验证

2.3.1 RT-PCR结果 与NG组相比较，PTMC组hsa_circRNA_001359表达水平上调4.6倍、hsa_circRNA_003416表达水平上调3.82倍、hsa_circRNA_104982表达水平上调2.95倍，上述基因的表达水平显著上升(P<0.01)。与NG组相比较，PTMC组hsa_circRNA_043614表达水平下调2.56倍、hsa_circRNA_103944表达水平下调1.75倍、hsa_circRNA_104755表达水平下调2.27倍，上述基因的表达水平显著下降(P<0.01)(表6)。

表6 RT-PCR验证结果与芯片结果比较

注：circRNA：circular RNA序列号；Regulation：“up”表示表达上调，“down”表示表达下调。

2.3.2 扩大样本进行RT-PCR验证 经RT-PR芯片结果验证，挑选倍数最高且P值小的circRNA001359，取NG组7例与PTMC组7例血清标本进行RNA纯度的检测，质检通过。经RT-PCR检测NG与PTMC，并进行对比，表明hsa_circRNA_001359表达水平显著上调5.8倍(P<0.01)。

3 讨论

基因芯片检测恶性肿瘤的标记物是目前基因检测较为常用的方法。Zhang等[16]对非小细胞癌组织和癌旁组织进行circRNA芯片分析检测，结果表明hsa_circ_0014130是显著上调的，并分析了该circRNA与非小细胞癌组织患者临床特征的关系，提示前者可能参与了非小细胞癌组织肿瘤的发生与发展，该研究结果提示hsa_circ_0014130可能作为一种新的非小细胞癌组织诊断生物学标志物。Zheng等[17]收集原发性胆管炎患者的血浆，同期收集健康人群的血浆，进行circRNA芯片检测，结果提示circRNA的表达异常可能在原发性胆管炎发病的机制中发挥着重要的作用，研究结果表明hsa_circ_402458有望成为原发性胆管炎的候选生物学标志物。Xu等[18]对肺部鳞状细胞癌进行研究，收集肺鳞状细胞癌的癌组织和癌旁组织，对两者进行circRNA芯片检测分析，生物学数据分析和后期的验证，研究表明circRNA在肺鳞状细胞癌中存在差异表达，并且与肺鳞状细胞癌的癌变密切相关。该研究提示hsa_circRNA_103827和hsa_circRNA_000122可能可以作为该疾病的潜在预后生物学标志物和治疗的靶点。但应用血清标本进行芯片检测明确PTMC性质的研究尚未查阅到。

本研究使用12 900个circRNA探针对6例血清标本中circRNA的表达水平一致性及表达差异进行分析。对被检测的6例血清标本，以箱式图的形式进行质量评估，结果显示2组中circRNA的表达水平均值为4～6，表明一致性和可比性较好。随后研究采用火山图直观地显示2组中circRNA表达水平的变异度。

本研究结果显示，NG和PTMC血清中circRNA表达显著上调的有 14个和下调的有6个。挑选出上调circRNA 3个，分别是：hsa_circRNA_001359、hsa_circRNA_003416和hsa_circRNA_104982，下调circRNA 3个，分别是：hsa_circRNA_043614，hsa_circRNA_103944和hsa_circRNA_104755。考虑以上circRNA表达的差异可能是调控PTMC的发生与发展，但上述的circRNA是通过何种途径影响PTMC的发生与发展，还需要进一步的研究。釆用生物信息学方法分析得出差异性circRNA线性基因本体分析，包括生物学过程、细胞组分及分子功能。对存在1.5倍以上差异的circRNA采用美国Arraystar公司的miRNA结合位点预测软件预测5个与CircRNA具有高匹配值的miRNA结合位点。本研究还预测了circRNA的潜在miRNA靶点，以KEGG数据库对差异表达circRNA预测结合的与PTMC相关的miRNA可能调控的靶基因进行生物信号通路分析，构建circRNA-miRNA-mRNA网络图，探讨circRNA表达异常在PMTC中发挥的可能作用。该网络阐明了circRNA、miRNA和mRNA之间潜在的ceRNA关系。

经RT-PCR芯片检测的验证，表明hsa_circRNA_001359、hsa_circRNA_003416、hsa_circRNA_104982、hsa_circRNA_043614、hsa_circRNA_103944、hsa_circRNA_104755的验证和芯片检测的调控趋势是一致的。

经查阅大量的文献得出，hsa_circRNA_001359高配位的hsa-miR-130b-5p，hsa-miR-182-5p和hsa-miR-451a均与甲状腺乳头状癌的发生和发展密切相关。

根据本研究结果结合文献分析，选取hsa_circRNA_001359作为PTMC诊断的靶点，并经RT-PCR方法进行扩大样本量的验证。结果表明hsa_circRNA_001359可能可以作为诊断女性、甲状腺结节患者术前诊断PTMC性质的生物学标记物。