基于二代测序的肺癌患者外周血ctDNA突变与临床病理特征的相关性研究

2019-08-03刘苗苗南岩东房延凤姜华

国际呼吸杂志 2019年14期

刘苗苗南岩东房延凤姜华

空军军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科,西安 710038

肺癌目前为全球癌症死亡的最常见原因,每年超过100万人死于该癌症,其发病率及致死率仍呈上升趋势[1-2]。非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌发病总数的80%～85%,临床上以手术、化放疗等综合治疗为主,一定程度上改善了患者的生存及预后。但在实际临床诊疗中,75%肺癌患者一旦确诊均为中晚期,治疗效果并不理想。整体来说患者的5年生存率仅仅约为13%,给个人家庭和社会带来沉重负担。随着研究的不断深入,分子检测尤其是基因检测在NSCLC中的诊疗价值逐渐凸显,成为学者们的研究热点。

传统基因检测技术包括突变阻滞扩增系统PCR、高效液相色谱、Sanger测序等。其主要针对特定的某个基因进行检测,但不能深入研究基因组数量及种类的变化,且对癌组织与血液样本的提取与保存标准较高[3-4]。而二代测序 (next generation sequencing,NGS)具有高通量,能够在单个组织或血液样本中同时检测出大部分基因组的改变,联合临床病理特征对肺癌的诊断、靶向治疗与预后进行持续性监测,并且对发现某些潜在的或稀有的突变位点有一定临床应用价值[5-6]。

在临床诊断过程中,基于组织的基因检测仍然是金标准。但在实际临床工作中,肿瘤组织样本获取风险高、重复活检较难和肿瘤异质性等给组织样本获取提出了难题。体液检测较组织活检具有无侵袭性、风险低、取材方便等优势,主要包括血液、痰液、尿液等体液中的循环肿瘤DNA (cell-free DNA,ctDNA)、循环游离DNA (circulating cellfree DNA,cf DNA)、循坏肿瘤细胞 (circulating tumor cell,CTC)与外泌体。ct DNA 可在组织样本难以获取时作为合适的替代选择,为肺癌的诊断、治疗及病情监测提供更加全面的基因概括。本研究收集肺癌患者血液样本基于NGS技术进行表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)、鼠类肉瘤病毒癌基因 (kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、人第 10 号染色体缺失的磷酸酶 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、MNNG HOS转化基因(MNNG HOS transforming gene,MET)、磷脂酰肌醇激酶催化亚基α多肽基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphonate 3-kinase,catalytic subunit,alpha polypeptide gene；PIK3CA)及人抑癌基因TP53 (TP53)基因检测,旨在探讨肺癌患者血液ctDNA 检测上述基因突变与临床病理特征之间的相关性,分析影响各个基因发生突变的危险因素以及相互之间的关系,为临床个体化治疗提供指导。

1 对象与方法

1.1 研究对象前瞻性纳入2017年12月至2018年7月就诊于空军军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科194例肺癌患者,年龄 (59.34±9.63)岁,年龄范围为33～81岁；男133例,女61例；有吸烟史106例,无吸烟史88例；病理类型中,腺癌90例,鳞癌56例,小细胞癌48例；分化程度中低、中和高分化例数分别为132、57和5例；临床分期中Ⅰ～Ⅳ期例数分别为13、24、57和100例；转移患者163 例,未转移患者31 例。入组标准：(1)经组织学或病理学诊断为肺癌的患者；(2)所有受试者均为首诊或既往3 个月前接受过治疗；(3)临床病例资料完善； (4)所有受试者知情同意。排除标准：(1)肝肾功能异常；(2)合并其他系统原发性恶性肿瘤或器官功能障碍性疾病；(3)病理诊断不明确；(4)临床资料不完整；(5)不愿意配合者。记录并分析肺癌患者的临床病理特征,主要包括：年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型、分化程度、转移、临床分期的临床资料。临床分期严格按照国际抗癌联盟第八版肺癌TNM 分期标准执行[7]。本研究通过空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准 (第K201709-01号)。

1.2 样本收集肺癌患者均采集空腹静脉血10 ml于2个5 ml EDTA 抗凝管中,将EDTA 抗凝管置于4 ℃、离心半径300 mm、6 000 r/min 离心机(型号：LX-300,中国江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)中离心10 min,在操作台内提取上清液分别平均置于3个2 ml离心管内；将3个2 ml离心管置于4 ℃、离心半径300 mm、16 000 r/min离心机中离心10 min,在操作台内提取上清液于2个2 ml冻存管 (Corning430659 2.0 ml外旋冻存管)中,上清液总体积不低于3 ml,用自封膜将冻存管口进行密封,储存于-80 ℃低温冰箱内。所有过程在2 h内完成。所有样本干冰运输至上海真固生物科技有限公司实验室,用血液DNA 提取分离试剂盒 (批号：55114,荷兰控股QIAGEN 有限责任公司)完成ct DNA 的提取,7 d内完成检测。

1.3 DNA 的提取与定量ct DNA 提取依据QIAGEN QIAamp 循环核酸试剂盒 (批号：51304,荷兰控股QIAGEN 有限责任公司)操作手册提取,提取好的ctDNA 含量采用Qubit®3.0荧光定量仪和Qubit双链DNA 高敏感度检测试剂盒(批号：Qubit®3.0,美国Invitrogen公司)测定,定量方法依据Qubit®3.0操作说明。

1.4 文库构建及测序采用Qubit®3.0荧光定量仪和Qubit双链DNA 高敏感度检测试剂盒测定,定量方法依据Qubit®3.0操作说明。采用Miseq测序仪对构建的DNA 文库进行测序,操作流程依照MiSeq的文库和测序准备及MiSeq系统使用手册,测序读长为PE50。

1.5 统计学分析基于云端自主开发的分析流程(真固数据分析流程)得出相应的检测结果。采用SPSS 19.0软件进行数据分析,计数资料用例数表示,采用χ2检验进行组间比较,spearman相关分析基因之间的相关性。对单因素分析结果中有统计学意义的指标采用二 (多)元logistic回归分析行危险因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、KRAS基因突变与临床病理特征之间的相关性 EGFR 基因突变在性别、吸烟史方面差异有统计学意义,尤其在女性 (P=0.007)、不吸烟 (P=0.034)的肺癌患者中EGFR 基因突变显著升高；KRAS 基因突变与转移显著相关(P=0.029),转移者KRAS基因突变较非转移者突变多。PTEN、MET 及PIK3CA 基因突变在年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、临床分期、转移之间均无相关性 (P值均＞0.05)。TP53基因突变与病理类型间显著相关 (P=0.001),其中小细胞癌较腺癌与鳞癌TP53突变发生较高,与其他临床病理特征之间均无相关性(P值均＞0.05)。见表1。

2.2 EGFR、KRAS及TP53基因突变与性别、吸烟史、转移之间的二 (多)元Logistic回归分析性别 (OR=2.406,95%CI：1.268～4.565,P=0.007)与吸烟史 (OR=0.516,95%CI：0.279～0.956,P=0.035)是EGFR 突变的危险因素 (表2)；腺癌(OR=0.244,95%CI：0.112 ～0.529,P=0.000)和鳞癌(OR=0.333,95%CI：0.144～0.770,P=0.010)是TP53突变的危险因素 (表3)。

2.3 EGFR、KRAS、PTEN、MET、PIK3CA、TP53基因之间的相关性 EGFR 与PIK3CA 之间具有相关性 (r=0.201,P=0.005),与PTEN、MET、TP53之间均无相关性 (r=0.118、-0.102、0.088、0.107,P=0.101、0.157、0.225、0.138)；KRAS与PTEN、MET、PIK3CA、TP53之间均显著相关 (r=0.224、0.221、0.242、0.144,P=0.002、0.002、0.001、0.045)；PTEN 与 MET、PIK3CA、TP53 之间均无相关性 (r=0.089、-0.012、-0.094,P=0.218、0.866、0.194)；MET与PIK3CA有相关性 (r=0.192,P=0.007),但与TP53之间无相关性 (r=0.084,P=0.246)；PIK3CA 与TP53之间无相关性 (r=0.128,P=0.075)。

)(例系关的间之征特理病床临与变突因53基TP CA 及T、PI K3 N、ME、P TE R、KR AS GF 1 E表P 值.672值53χ20.180 0 TP性阴45性阳53 P 值.727值CA K3χ20.122 0 PI 性阴83性阳15 P 值.589值T ME χ20.293 0性阴90性阳8 P 值值7 0.472 EN χ20.51 PT 性阴88性阳10 P 值.865值AS χ20.029 0 KR性阴86性阳12 P 值81.1值FR χ21.793 0 EG性阴72性阳26数例98标指）床（岁临龄 ≥60年47 49 83 13 86 10 83 13 85 11 62 34 96＜60.207人为1.590 0.512 0.429 00.001.626.415.783 3.699；T 0.936 0 2.854 0 0.076 0 P5 13基亚593348445228122306091226457814 α基亚化742858443828363277241231558517催酶激.723醇0.125 0.485 0.487 0.438 1.650 0.353 2.081 0.366 3.172 0.769 0.086 0肌酰脂磷A 为113538977804739551 11012234784 14026；PIK 3C 208171110990622111016235因基化.376转S 0.783 0.563 0.335 0.944 0.115 0.583 1.080 0.747 1.227 0.448 0.576 0HO NG MN 119579581815144453 11911215391 14927；M ET 为14411795414132349144酶酸.713磷的3 0.485.332.218.447.310失0.159 0 0.488 0 2.208 0 3.043 0 2.661 0 1.03缺体色染8 11 5395767651444470 12112253852 1429 10号158111214541101222415212第人.912N 为0.012 0.485 0.489 0.423 1.720 0.637 0.901 0.255 4.062 0.009 6.847 0；P TE因基癌毒117549576785241551 11513235085 14031病瘤肉16711121247061701715230类鼠为07S.03481896848 7.406 0.0 4.480 0.0 5.019 0.4 1.431 0.1 5.052 0.1 2.093 0；K RA体受子0 10 3480545543363438992140646 1118因长生33272634351312214434317364713皮表13361 10688905648557 132132457 100 16331R 为53癌TP GF型胞度化化化期：E 因史类癌癌细程分分分分期期期期注基别男女烟有无理腺鳞小化高中低床ⅠⅡⅢⅣ 移是否癌性吸病分临转抑

3 讨论

个体化精准治疗死亡概念在肺癌治疗领域效果显著,此前需检测相应的突变基因进而选择最佳靶向药物[8-9]。考虑到肺癌患者外周血中的ct DNA 来源于肿瘤组织,其包含了肿瘤组织的全部遗传信息,因此获取血液样本便克服了取材大小、肿瘤生长部位、肿瘤异质性等因素的干扰,提高了肺癌的阳性诊断率。NGS技术较传统检测手段具有单次高通量检测体内多个基因的状态及变化情况,丰富了临床上对肺癌患者的诊断、治疗及疾病预后持续性监测[10-11]。通过检测外周血中ctDNA 的变化情况,可以动态监测疾病的变化情况并且制定最精准的治疗方案。随着NGS 技术不断快速地发展,ct DNA 的检测在肺癌中的应用愈加重要[12-13]。本研究旨在探讨肺癌患者血液中EGFR、KRAS、PTEN、MET、PIK3CA、TP53 基因与临床病理特征之间的相关性,进一步分析肺癌患者基因突变的危险因素以及各个基因之间的关系,指导临床个体化治疗。

本研究显示EGFR 在不吸烟的女性肺癌患者中的突变率显著升高,和既往研究结果一致[14-15]；KRAS基因突变与转移相关,转移者KRAS 基因突变较多,提示KRAS基因突变在临床分期较晚时被检测,意味着KRAS阳性突变者的治疗效果及预后较差。既往研究表明KRAS在EGFR 信号传导通路中具有重要作用,位于通路下游,一旦KRAS持续活化,多种肿瘤增殖及分裂因子将被持续地激活,使针对EGFR 的靶向药物疗效降低,甚至耐药[16-17]。PTEN、MET、PIK3CA 基因突变在年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、临床分期、转移方面差异均无统计学意义,提示3种基因在肺癌的一般临床特征中无明显差异,表明上述基因的检测不易受临床基线资料影响。TP53基因突变与病理类型显著相关,其中小细胞癌较腺癌与鳞癌TP53突变发生较高,并且差异具有显著的统计学意义,提示TP53基因可作为小细胞肺癌的辅助诊断指标。Mounawar等[18]总结了116 例肿瘤患者的研究,表明TP53频繁突变预示了预后不良。本文虽然未做生存分析得出相应地结论,但小细胞肺癌在肺癌病理分型中预后较差,可间接表明了与Mounawar等[18]的结果一致。在基因突变与临床病理特征之间的logistic回归分析中,我们分别进行了EGFR 突变与性别和吸烟史、KRAS 突变与是否转移、TP53 突变与病理类型之间的二(多)元logistic回归分析。结果显示：女性患者EGFR 突变的风险较男性高,不吸烟者发生EGFR基因突变的风险比吸烟者高,明确了性别与吸烟史是肺癌患者发生EGFR 突变的危险因素,表明不吸烟女性患者行基因检测时须重视EGFR 基因,可为TKI靶向治疗提供依据；KRAS基因突变在转移者与非转移者间差异具有统计学意义,尚不能认为KRAS突变是肺癌患者发生转移的危险因素。TP53基因突变在腺癌、鳞癌、小细胞癌3种组织类型肿瘤发生风险的差异均有统计学意义,提示病理类型时肺癌患者发生TP53突变的危险因素,对肺癌病理类型鉴别时作为辅助指标,尤其是对小细胞肺癌。此外,在探讨基因相互之间的关系方面,本研究发现EGFR 与PIK3CA 之间有相关性,与KRAS、PTEN、MET、TP53 之间均无相关性,表明EGFR 与KRAS、PTEN、MET、TP53基因不会同时突变。既往有实验表明EGFR、PTEN、TP53基因在乳腺癌中具有相互调控的作用。KRAS与PTEN、MET、PIK3CA、TP53 之间均显著相关,可能在针对EGFR 靶向药物耐药过程中具有一定的协同作用,亦有文献表明在结直肠癌转移灶中 KRAS 与 MET 之间不存在相关性。MET 与PIK3CA 之间有相关性,有文献提出PIK3CA 基因突变更加倾向于和其他基因突变同时存在,与本研究结果一致[19]。