精子激活剂在辅助生殖技术中的应用研究

孔飞燕 综述 常德辉 审校

甘肃中医药大学，中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院（甘肃兰州730000）

在临床工作中，不孕不育是一种比较常见的病症，大约在15%的夫妇中存在不孕不育的情况，其中男性方面导致不育约为30%-60%[1]；而在男性不育的类型中，特发性男性不育是最常见的，约占70%～75%，其中包括无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症，而对于少精子症和弱精子症，其原因繁多，机制复杂。随着对弱精子症研究的深入，许多致病的原因和治疗的方法被学者发现和应用，但对于其中大多数的原因和发病机制仍无圆满的解释；同样，许多药物仍然处于实验研究阶段，无充分证据支持其应用于临床的可行性。目前，主要以内分泌治疗和辅助生殖技术作为治疗弱精子症的的有效措施，后者中常用的人工授精、体外受精-胚胎移植等技术已经取得了优良的成果，为生殖医学领域中治疗男性不育开辟了新的路径。但是，若要使辅助生殖技术获得成功，在人工授精前，必须使精子的各项功能达到优良状态，这是必要的前提条件。在获得弱精子症患者的精液样本后，要对样本进行一系列的处理过程，使得人工授精前精子达到最佳的状态，其中包括精子超低温保存、提高精子活力、改善精子微环境等，而提高精子活力作为处理过程的中心环节，精子激活剂已经成为研究的热门。

一、改善精子成熟和运动微环境的精子激活剂

近年来，随着广泛的研究，精子的缺陷和精子发生以及成熟所依赖的微环境改变均会影响精子质量以及受孕率，这一观点已经得到学术界广泛的认可。而针对这种情况，许多研究者试验多种生物制剂来替代微环境中缺失的物质或者改善精液微环境。前列腺液作为精液的重要组成部分，占精液体积的六分之一[2，3]，前列腺液中含有多种蛋白，这些蛋白与精子液化、渐进性运动，抗菌和免疫学活性有关，对于离体后的精子功能的维持有很重要的作用。有Wei等[4]发现B7-H3也存在于前列腺液中，但是未证明B7-H3是否具有和其他蛋白一样的功能。为了验证B7-H3的功能，Wei等[5，6]进行了研究发现：B7-H3对于精子的运动有很重要的功能，可以改善精子的运动能力，并且其效能与浓度和时间呈一定的正相关性。在人体内，白细胞和幼稚精细胞可产生低浓度的氧化活性物质，后者在精子和卵子结合过程中起重要作用。但由于生殖器炎症等原因会使精液中的氧化活性物质明显增多[7]，研究证实高浓度的氧化活性物质会影响精子的运动能力，甚至破坏精子DNA的完整性[8，9]，同时，精液内存在的许多抗氧化物质[10]，比如：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸、维生素E、丙酮酸盐、谷胱甘肽、L-肉碱、牛磺酸、亚牛磺酸等，这些物质可拮抗产生的过量氧化活性物质，当精子排出体外后，精液中的这些抗氧化物质消耗，能力下降，同时产生大量助氧化物质[11]，最终导致精子活力降低，DNA完整性破坏。Björndahl等[12]研究发现Zn可以稳定核染色质，起到抗氧化作用，同时提升精子的运动能力。D型氨基酸具有刺激精子发生、合成和分泌激素的作用，且弱精子症患者的D型氨基酸含量较正常人明显减低[13]。辅酶Q10（Co-Q10）以稳定和活化两种形式存在于精子后精浆中，它与精子的浓度和精子的运动能力有密切的关系[14]。Talevi等[15]探究了Zn、天冬氨酸、以及Co-Q10的最佳浓度后，得到各自的浓度分别为10μg/mL、500μg/mL、40μg/mL时， 精子的运动质量最优。Giacone等[16]按照上面得出的最佳浓度，将三者结合后与精子共孵化，结果显示，精子的运动能力明显提高，同时，减弱了脂质过氧化过程。Yun等[17]设计实验，探索抗氧化剂对精子的运动活力的影响，分别将牛磺酸、半胱氨酸、谷胱甘肽以及三者的联合物加入精液中，结果与对照组相比后，牛磺酸在浓度为1mmol时，精子的各项运动参数（精子活力，曲线运动速度、直线运动速度、平均路径速度以及前向运动精子百分率）均有提高，但是三者联合使用时，精子的运动能力反而有明显的降低。精子在睾丸中形成后并不具备运动能力，当运输到附睾中的管道后，精子才获得了运动能力，而附睾中优良的内环境是精子成熟和获得运动能力所必须的，并且附睾内各段管道内的微环境也不完全相同，其中微环境中钙离子对于精子获能至关重要[18]，但是关于体外实验时钙离子的使用浓度，各家报道均不一样。Bhoumik[19]等对体外精子实验时钙离子浓度的选择进行了探索，在笔者的实验中，当外环境中钙离子的浓度为10μmol时，精子运动活性明显提升，而继续增加钙离子浓度时，精子的运动活性呈现出显著下降趋势。

二、辅助提升精子自身运动能力的精子激活剂

（一）生化介质类型精子激活剂

大量研究证实，cAMP介导精子获能过程中的酪氨酸磷酸化过程，而且生理试验[20，21]发现，cAMP甚至可以直接刺激精子，从而增加精子的能力。在精子获能的第一阶段，钙离子内流且活性氧离子产生，而活性氧离子中的过氧化氢以及钙离子随之刺激腺苷酸环化酶，后者被激活后可进一步增加cAMP的含量。肝素是刺激体外培养的牛精子获得动能的最常用化合物，属于黏多糖[22]，它通过结合浆膜表面的牛精液蛋白，使之发生构型改变，从而激活浆膜上的通道，细胞内cAMP随之增加[23]。Nabavi等[24]将等量的咖啡因加入含有小鼠精子和卵子细胞的T6和M16两种培养基中，通过实验得出结论，一方面咖啡因具有促进精子运动和刺激发生顶体反应，另一方面，培养基在激活精子方面同样具有重要的作用，并且两者结合时，效果明显增加。IA Barakat等[25]设计实验研究咖啡因、己酮可可碱、血管舒缓素对冷冻牛精子的超活化效应，同时探究各化合物的最佳效应浓度，经过实验得出：咖啡因在其浓度为5mmol对精子具有激活作用达到最佳；己酮可可碱也有促进精子活化的功能，其最佳效应浓度为1mmol，血管舒缓素对精子无明显活化作用。Pariz等[26]设计实验，探索咖啡因在低温冷藏人类精子复温后的不同时间内，对精子的激活效应是否有差异，经实验发现在复温15min时加入咖啡因后，其对精子的获能效应最强，并且复温后不运动的精子比例明显减少。环糊精载胆固醇复合物[27，28]促进低温冷藏复温后精子的运动并提高复温后精子的存活率。

一氧化氮作为活性氧的一种，它具有传递细胞信息[29]的功能，而且研究发现，一氧化氮对于精子获能和顶体反应均起到重要作用。大量的证据支持：只要一氧化氮的使用浓度不要超过生理浓度 （一般认为少于1微摩尔[30]），一氧化氮的可以发挥其重要生理意义。Wang等[31]对一氧化氮的使用浓度以及使用持续时间进行了研究，得到结论：在合适的浓度范围下，充足时间持续作用于精子对其获得动能非常有益。

神经生长因子作为哺乳动物中枢神经系统和外周神经系统的重要营养因子，同时对于内分泌和免疫系统同样很重要[32]。新的研究[33]发现神经营养因子和它的两个特异性受体 （TrkA和p75）广泛分布于生殖系统中，包括精子的头部和尾部[34]。Lin等将神经营养因子和精子共孵化，发现精子的移动距离明显增加，并且随着浓度的增大，精子移动的距离随之增加，呈现出剂量依赖性特征，同时达到A等级精子[36]的比例明显增加。

（二）射线类型精子激活剂

在上世纪，许多学者就注意到物理因素对精子的运动能力的影响，并且不断的精确研究提高精子运动能力的各因素，其中主要集中在激光照射使精子的运动能力获得提升，以及照射的元素，照射的计量和波长，被照射精子的质量，是否对细胞造成损害。Sato等[37]使用氪元素红激光，多样的照射方式对人精子进行照射，发现该激光可以明显提高精子的运动能力。Lenzi等[38]辅助使用计算机分析仪，通过测定精子运动的速率以及距离，充分证实了前者的结论。Yazdi等[39]对激光的照射剂量进行了研究，研究发现使用4～6J/cm2的放射剂量，持续照射40～60min后，人精子的运动能力明显提高。NSalama等[40]收集了27例人精子样本，其中包括弱精子症患者和正常成年男性两组样本，使用波长为636.6nm波长，总输出功率为13W的红光LED灯，距离试管5cm处对精子进行照射，通过测定精子肌酸激酶活性，进行低渗的肿胀测试和苯胺蓝染色后，证实精子的运动活力明显提高，可认为红光LED灯是一种安全使用的工具，对体外精子运动能高有很高使用价值。FrangezBan等[41]经过实验验证了上述结论，但是还得到另一结论，即LED灯的波长在470-850nm范围内时，精子的运动能力可得到明显提升。Harrison等[42]分别使用波长为660-850nm（100～400 J）的 LED 灯和波长为 810nm（2-4 J）的二极管激光对人类精子进行照射，结果显示中间值放射量的LED灯照射与2J放射量的二极管激光照射30min后，精子获得的动能最大。而国外有报道[43]进行的试验发现，随着照射剂量的增加，精子运动的速度逐渐降低。

目前对激光的作用机制尚未研究清楚，SB Doshi等[44-46]研究认为激光照射后，生物刺激会使细胞以及线粒体合成大量的ATP（三磷酸腺苷），为精子提供能量。国外有学者[47，48]认为，一定剂量激光会刺激细胞外的Ca2+向细胞内流动，而精子的鞭毛运动主要靠Ca2+的激活，所以会使精子的活力增强。而Lin认为[35]激光照射会刺激细胞膜，细胞质，线粒体产生大量活性氧，比如超氧阴离子，一氧化氮，过氧化氢等，这些物质作为第二信使调节精子获得动能，并激发顶体反应。SLuo等[49]将公羊精子置于碳离子（12C6+）放射的环境中，探究碳离子对精子的运动活力及存活率的影响，得出结论：0.1Gy的碳离子剂量是提高精子质量的最合适剂量。探讨机制后认为大剂量的离子放射可增加精子的糖酵解过程，产生大量烯醇化酶和ATP，为精子的运动提供充足能力。

（三）中药制剂型精子激活剂

虽然中药制剂治疗弱精子症的报道比较多，但只有部分中药的效果已经得到了基础试验的验证和广泛的认可。陈智等[50]研究刺五加水提物在体外对弱精子症患者的各项运动参数的影响，并且探究最佳效应浓度，经过实验后得出，刺五加水提物体对精子运动能力有很大提高，其最佳的效应浓度为10g/L。梁培育等[51]将黄芪注射液与弱精子症精子共孵化，检测精子中线粒体的功能，发现线粒体的活性明显提高，为黄芪提高精子活力提供了理论基础。Ayeleso等[52]对糖尿病小鼠模型的精液进行分析后得出，高血糖显著降低精子的运动能力，之后使用红棕榈油（2mL/d）和南非路易波士茶汁提取物（2%）对小鼠模型进行注射，7周后，提取小鼠的精液进行分析，结果显示红棕榈油和南非路易波士茶汁提取物提高了精子的直线运动速度和摆动频率。

三、小结

精子从发生到获得动能，再到具备与卵子结合成为正常胚胎，这其中的每个环节，每种物质以及每个条件，只要发生微小的变化，精子的质量或者生存的微环境就会发生明显变化，最终导致卵子不能正常受孕。而辅助生殖技术的核心环节，就是在体外为精子创造一个优良的微环境，包括温度、pH、多种无机离子、多种蛋白质，多种酶；同时，尽可能的纠正精子自身的缺陷，比如，线粒体产生能量不足，低温冷藏后对精子的损害等，使之在授精以前达到最优良的状态，从而增加受孕率。因此，一些研究者对体外精子的培养各个环节进行探索，包括对精子自身缺陷的纠正，微环境不良的改善，辅助精子在低温冷藏后复温过程中的动能的获得，以及降低体外精子的脂质过氧化损伤。但是，以上提到的各种精子激活剂中，许多仍处于实验阶段，有些试剂，如已酮可可碱、咖啡因等不良反应也有许多文献报道。使用一定激光照射，确实会增加精子的运动活力，但是关于其不良反应，却鲜有报道。对于试剂使用的剂量，各家报道有很大差异，如钙离子在外环境中的浓度，激光照射的剂量等。同时，对于多数研究，样本较少，研究指标单一，结论说服力较弱。所以，对于精子体外培养，大样本，多因素的广泛研究，以及后续的临床试验仍是必须的。