益气温阳方联合化疗对结直肠癌晚期患者外周血Treg细胞影响研究

陶智怡 王金平 陆烨 姜洪心

[摘要] 目的 探討益气温阳方联合化疗对晚期（ⅢⅣ期）结直肠癌患者外周血Treg细胞比率的影响及益气温阳方的抗癌机制。方法 方便收集2017年01月—2018年06月收治的56例晚期结直肠癌患者，分为研究组及照组。对照组患者进行化疗，研究组患者在化疗基础上口服益气温阳方，两组患者均以21 d为一周期。利用流式细胞技术检测治疗前及治疗2周期后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞表达水平。结果 对照组治疗后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率较治疗前下降不明显[（5.51±0.87）%vs（5.03±1.21%]，治疗前后差异无统计学意义（t=1.76，P>0.05），研究组治疗后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率较治疗前下降明显[（5.59±1.45）%vs（4.28±1.23）%]，差异有统计学意义（t=3.51，P<0.01），且研究组治疗后CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率明显低于对照组[（4.28±1.23）vs（5.03±1.21）]，两组治疗后的组间比较，差异有统计学意义（t=2.29，P=0.02）。另研究组Treg细胞的抑制率明显高于对照组[（0.22±0.17）vs（0.09±0.13）]，差异有统计学意义（t=3.18，P<0.01）。 结论 益气温阳方联合化疗能明显降低ⅢⅣ期结直肠癌患者外周血Treg细胞比率。通过降低Treg细胞水平，调节肿瘤免疫逃逸微环境来抑制肿瘤生长转移可能是益气温阳方扶正以抗癌的机制之一。

[关键词] 益气温阳;结直肠癌;免疫逃逸;CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

[中图分类号] R276.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）04（c）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy on the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. To investigate the anticancer mechanism of Yiqi Wenyang Decoction. Methods Convenient select a total of 56 patients with advanced colorectal cancer from January 2017 to June 2018 were collected. They were divided into control group and study group. The control group was given chemotherapy. The study group was given both Yiqi Wenyang Decoction and chemotherapy. The two groups were treated with 21 days as a treatment cycle. The expression level of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in peripheral blood was detected by flow cytometry before treatment and after 2 treatment cycles. Results The ratio of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the control group was not significantly lower than that before treatment [（5.51±0.87）% vs （5.03±1.21%]， which did not make significant difference between the ratio before treatment and the ratio after treatment （t=1.76， P>0.05）. The ratio of CD4+ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the study group was significantly lower than that before treatment [（5.59±1.45）% vs （4.28±1.23）%]， which was statistically significant （t=3.51， P<0.01）. And the ratio of CD4+ CD25++ CD127low/-Treg cells in the study group was significantly lower than that in the control group [（4.28±1.23） vs （5.03±1.21）]， and the difference between the two groups after treatment was statistically significant （t=2.29， P=0.02）. The inhibition rate of Treg cells in the study group was significantly higher than that in the control group [（0.22±0.17） vs （0.09±0.13）]， which was statistically significant （t=3.18， P<0.01）. Conclusion Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy could significantly decrease the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. Through decreasing the level of Treg cells and regulating tumor immune escape microenvironment to inhibit tumor growth may be one of the Yiqi Wenyang Decoctions mechanisms of strengthening the body resistance to fight cancer.

[Key words] Yiqi Wenyang; Colorectal cancer; Immune escape， CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

结直肠癌是全球最常见肿瘤之一，中晚期结直肠癌患者化疗后多因药毒攻伐导致脏腑虚损，处于“脾肾阳虚”状态，治疗以健脾温肾，扶正抗癌为主。本研究以结直肠癌ⅢⅣ期患者作为研究对象，观察益气温阳方联合化疗对结直肠癌患者外周血调节性T细胞（Treg）的影响，讨论益气温阳方对肿瘤免疫逃逸的作用。

在肿瘤发展过程中[1]免疫逃逸是肿瘤形成的关键。调节性T细胞是具有免疫抑制功能的T细胞亚群，它参与肿瘤免疫逃逸过程，促进肿瘤的发生发展，大多数肿瘤患者Foxp3+Treg细胞升高往往提示预后不良[1-3]。联合使用CD4+，CD25+和CD127可表达高纯度的Foxp3+Treg细胞，肿瘤患者外周血CD4+CD25+ CD127low/-Treg水平与肿瘤预后成负相关[4]，能在一定程度上反映肿瘤治疗疗效[5-6]。该研究截止至2018年6月，共方便选取研究对象56例，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

方便收集苏州市立医院（东区）收治的结直肠癌晚期（ⅢⅣ期）患者56例作为研究对象，其中男37例，女19例，年龄35～81岁，平均（61.98±10.74）岁。对照组30例，研究组26例。所有入选患者均符合《结直肠癌诊疗规范》中的结直肠癌诊断标准，并经活检或手术病理确诊为结直肠癌。根据《AJCC癌症分期手册》第7版结直肠癌TNM分期标准，Ⅲ期18例，Ⅳ期38例。两组间性别构成和年龄差异无统计学意义（P>0.05）。

纳入标准：①经末次化疗后1个月，未行放疗、生物治疗、中药及其他抗癌治疗;②无严重心、肝、脑、肾等器质性损害和骨髓造血功能障碍者;③卡氏评分（Kamofsky）≥60分;④预计生存期>4个月;⑤签署知情同意书，自愿接受治疗，依从性好，可随访;本试验得到医院伦理委员会批准。

排除标准：①不符合上述纳入标准;②合并其他嚴重疾病③脑转移引起精神意识障碍及精神病不能合作者;④过敏体质及对药物过敏者;⑤患者呕吐频繁，或厌服中药。

1.2  主要试剂和仪器

中药药材：益气温阳方：黄芪30 g（批号：1703120 09），党参10 g（批号：170201005），茯苓10 g（批号：170418014），炙甘草10 g（批号：161129006），炒白术10 g（批号：170308002），薏苡仁30 g（批号：170115010），制附子10 g（批号：170415001），干姜6 g（批号：1612140 03），仙灵脾10 g（批号：170215010）（生产厂家：苏州天灵中药饮片厂）。煎煮工艺：苏州天灵中药饮片厂自动化煎煮设备标准煎煮工艺。检测试剂：Fluorescein isothiocyanate （FITC）-CD4 +（BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ， USA）;antigen-presenting cells （APC）-CD25 +（BD Biosciences）;PE-CD127（BD Biosciences）;溶血素（BD Biosciences）;检测仪器：流式细胞仪（BD FACS Diva软件）;分析流式数据软件：BD FACS Diva软件。

1.3  方法

1.3.1  治疗方法  对照组结合患者既往治疗方案，参照《NCCN结肠癌临床实践指南》，选择FOLFOX或FOLFIRI方案的化疗，并根据患者一般情况调整化疗剂量。研究组在对照组基础上予以中药益气温阳方（药物组成：黄芪30 g，党参10 g，茯苓10 g，炙甘草10 g，炒白术10 g，薏苡仁30 g，制附子10 g，干姜6 g，仙灵脾10 g），并根据患者证型进行适当剂量调整;水煎服，分早晚2次服。21 d为1个治疗周期，每周期第8天开始服用中药，持续服用14 d，2组患者进行治疗2周期。

1.3.2  标本采集  第一周期治疗前以及第二周期21 d治疗后，清晨空腹使用肝素抗凝真空采血管采集外周静脉血2 mL，EDTA抗凝充分混匀确认无凝血，20℃～25℃室温保存，6 h内进行流式抗体染色。

1.3.3  指标检测  流式细胞术检测CD4+ CD25+CD127low/-细胞：使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。取100 uL全血，分别加入抗人 （FITC）-CD4+、 （APC）-CD25+、PE-CD127各5 uL，另设同型对照管，补偿管，涡旋震荡后，4℃避光孵育15 min，加入红细胞裂解液2 mL，涡旋后室温孵育15 min。以2 mL PBS1800 r/min离心洗涤5 min，弃上清，将细胞悬浮于0.5 mL PBS洗涤液中，振荡混匀后上机检测。设定淋巴细胞为Rl门内细胞，CD4+细胞为R2门内细胞，测定CD25+CDl27low/-细胞占CD4+细胞的百分比。

1.4  统计方法

应用SPSS 17.0 统计学软件，实验数据以均值x，标准差（x±s）表示，符合正态分布的数据两组间比较采用两独立样本t检验，非正态分布数据两组间比较采用两独立样本χ2检验，相关性分析采用Spearman 等级相关系数，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

①对该研究中56例结直肠癌患者数据的统计分析显示，治疗后两组患者外周血CD4+ CD25+CD127low/-Treg细胞占CD4+细胞比率都存在部分患者上升、部分患者下降（上升9例，下降47例），总体Treg细胞比率较治疗前下降（P<0.05），图1。

②研究组与对照组患者在治疗前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率差异无统计学意义（P>0.05）。对照组患者治疗后与治疗前Treg细胞比率未显示差异无统计学意义（P>0.05），研究组治疗后与治疗前Treg细胞比率差异有统计学意义（P<0.05）。研究组治疗后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率低于对照组，差异有统计学意义（t=2.29，P=0.02）。

③研究组治疗后的Treg细胞比率较对照组下降明显，研究组Treg细胞的抑制率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。说明益气温阳方联合化疗对于结直肠癌患者Treg细胞的抑制程度高于单纯化疗。

3  讨论

肿瘤免疫治疗（cancer immunotherapy）是肿瘤学近年来最重要的研究方向[7]。针对肿瘤免疫逃逸机制的治疗在部分类型的肿瘤患者取得了长期缓解的疗效[8]。在免疫编辑的过程中，免疫逃逸是肿瘤形成的关键。免疫逃逸的机制包括肿瘤细胞的自身修饰、代谢和肿瘤微环境的两方面改变[9]。肿瘤微环境中存在大量包括调节性T细胞（Treg）在内的抑制性免疫细胞。Treg细胞能够分泌IL-10，TGF-β等因子抑制效应性T细胞及NKT等的增殖和功能，对于效应性T细胞抗肿瘤有抑制作用，在多种实体肿瘤的免疫逃逸中起重要的作用[10]。

中医认为结直肠癌病位在大肠，脾肾亏虚为本，邪毒瘀滞为标，二者互为因果，互相影响。化疗是广泛性细胞杀伤性的抗癌方法，结直肠癌化疗后患者表现出纳差消瘦、神疲乏力、畏寒腹泻、面色晦暗、舌淡暗苔白、脉沉迟无力等症状，处于“脾肾阳虚”的免疫抑制状态。

在“人是一个有机整体”的理论指导下，中医学认为分析病理机制时应首先着眼局部病变引起的整体反应。在结直肠癌化疗后，“脾肾阳虚”的机体整体状态为肿瘤提供了有利的生长、逃逸环境，循环肿瘤细胞、休眠细胞和微转移灶则成为肿瘤复发的种子。肿瘤微环境中发生的免疫逃逸正是肿瘤作用于机体、机体免疫对肿瘤的整体反应。因此，治疗时宜扶正培本，减轻化疗毒副反应，改善机体肿瘤内环境、及纠正机体肿瘤免疫功能抑制状态。化疗后联合益气温阳方治疗体现了中医扶正以抗癌的思想。

益气温阳方以黄芪四君子汤加四逆汤为主方。黄芪四君子汤益气健脾，四逆汤扶正温阳，联合薏苡仁健脾胜湿，仙灵脾温煦肾阳，共奏益气温阳之功。基础与临床研究[11-13]证实益气温阳类中药对于肿瘤免疫逃逸有调节作用。譚佳妮等[11]通过荷瘤小鼠试验，证实含有益气中药的消癌解毒方具有显著抑制结肠癌增殖的作用，其机制可能与减少外周血内Treg细胞的分布及肿瘤组织中 Foxp3 的表达进而影响其下游信号通路传导相关。周波等[12]通过对胃癌 IV期患者的临床研究发现参苓白术散能降低胃癌IV期患者外周血 CD4+CD25+Tregs[（28.87±8.54）%vs（10.12±4.32）%]。在该次研究中，两组结直肠癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞占CD4+细胞比率在治疗前后都存在部分患者上升、部分患者下降，总体Treg细胞比率较治疗前下降（P<0.05）。这说明Treg细胞检测在一定程度上能反应治疗效果。研究中选取研究组与对照组患者在治疗前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞比率无明显统计学差异，而研究组治疗后的Treg细胞比率（4.28±1.23）%较对照组（5.03±1.21）%下降明显（P<0.05）;研究组Treg细胞的抑制率（0.22±0.17）显著高于对照组（0.09±0.13），有显著统计学意义（P<0.01）。说明益气温阳方联合化疗对于结直肠癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg细胞的抑制程度高于单纯化疗。通过降低结直肠癌患者外周血Treg细胞水平，调节肿瘤免疫逃逸微环境来抑制肿瘤生长转移可能是益气温阳方扶正以抗癌的机制之一。临床运用益气温阳法联合化疗能够更好的提高患者的肿瘤免疫功能，提高其生存质量。因益气温阳法对肿瘤免疫逃逸的调节作用，将其与靶向治疗相结合以提高靶向药物疗效并作用于临床可能是未来的研究方向。

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（收稿日期：2019-01-21）